張劉生 李正芳 張英育 蒙雁飛 井燕河 劉維英

1.蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，蘭州 730000 2.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院，蘭州 730000

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合癥(obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome,OSAHS)患者睡眠時體內(nèi)反復(fù)發(fā)生低氧/復(fù)氧損傷過程，使機體長期處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，氧化與抗氧化體系失調(diào)，導(dǎo)致氧自由基及其代謝產(chǎn)物過量聚集[1]。近年來,OSAHS患病率在我國逐漸升高，已成為心血管系統(tǒng)發(fā)病率升高的獨立因素[2]。氧化應(yīng)激通過破壞成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞之間的平衡來影響骨代謝,進而引發(fā)骨質(zhì)疏松[3]。間歇低氧作為骨質(zhì)疏松的危險因素已受到高度關(guān)注,但間歇低氧誘發(fā)骨代謝指標(biāo)改變的機制和動物實驗鮮有報道。本研究通過間歇低氧/復(fù)氧模型的建造，測定間歇低氧/復(fù)氧條件下大鼠骨代謝指標(biāo)骨礦鹽含量、血清B-ALP、各部位BMD，氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD、MDA水平，炎癥反應(yīng)指標(biāo)IL-6、TNF-α表達水平來探討間歇低氧/再氧可能誘發(fā)骨代謝改變的發(fā)病機制，為臨床了解OSAHS患者繼發(fā)骨質(zhì)疏松的病理特征及其預(yù)防提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

8周齡雄性SPF級SD大鼠20只，體質(zhì)量180～220 g，由甘肅省中醫(yī)學(xué)院動物中心提供。隨機分為IH組和NC組，每組10只,用苦味酸分別對兩組大鼠進行標(biāo)記。

1.2 主要實驗器材及試劑

1.2.1實驗器材：動物飼養(yǎng)艙(蘇州市馮氏實驗動物設(shè)備有限公司),ASD-3D愛華電子計重秤(深圳愛華衡器有限公司),氣體減壓閥(上海沃原閥門有限公司),電磁式空氣壓縮機(浙江森森實業(yè)有限公司),H48S-S數(shù)顯時間繼電器(上海一開集團日科電器),電磁閥(浙江德力西電氣有限公司),氣體流量計(安徽桐城有機玻璃儀器制品有限公司),測氧儀(浙江新安江分析儀器二廠),雙能X線骨密度儀(General Electric Company WI53717-1915 USA)，全自動生化分析儀(美國貝克曼庫爾特公司)，日本日立716全自動生化儀， r-911全自動放免計數(shù)儀(中國科技大學(xué)實業(yè)總公司生產(chǎn))。

1.2.2實驗試劑：大鼠骨堿性磷酸酶酶聯(lián)免疫試劑盒(美國ADL公司),動物飼料(北京科澳協(xié)力飼料有限公司),醫(yī)用氮氣，純度>99%(蘭州榮成有限責(zé)任公司)，醫(yī)用氧氣(蘭州方圓建化有限責(zé)任公司),戊巴比妥鈉鹽溶液(上海靜融生物科技有限公司)，血漿TNF-α、IL-6試劑盒(北京華英技術(shù)研究所)，血漿SOD、MDA試劑盒(北京華英技術(shù)研究所)。

1.3 造模方法

將IH組放入間歇低氧模擬艙內(nèi)，向艙內(nèi)循環(huán)充入氧氣，氮氣和壓縮空氣，循環(huán)周期為120 s,輸入純氮氣30 s,靜息10 s，輸入純氧氣20 s，輸入壓縮空氣60 s,氮氣、氧氣、壓縮空氣和靜息期的轉(zhuǎn)換由時間計電器定時控制電磁閥來完成。低氧時艙內(nèi)氧濃度最低6～7%，維持30s；復(fù)氧后艙內(nèi)氧濃度維持在20～21%，維持60秒。實驗時間設(shè)置為每天8 h(9am-17 pm)，每周7天，共8周。將NC組大鼠在每天相同時間置入相同規(guī)格的動物飼養(yǎng)艙內(nèi)，艙內(nèi)通入相同流量的壓縮空氣，維持艙內(nèi)氧濃度20-21%。所有動物飼養(yǎng)艙內(nèi)設(shè)置飲食設(shè)備，實驗期間大鼠正常飲食。每天觀察大鼠飲食、睡眠、精神、活動情況，每天采用ASD-3D愛華電子計重秤分別稱重IH組和NC組大鼠體重[4]。

1.4 試驗方法

間歇低氧/復(fù)氧造模8周后，用戊巴比妥鈉鹽溶液麻醉，打開胸腔，右心房取血，血液離心后取上清液保存于-80℃的冰箱,利用全自動生化分析儀測定血清B-ALP水平，日本日立716全自動生化儀比色法檢測血漿SOD、MDA， r-911全自動放免計數(shù)儀放射免疫法檢測血漿TNF-α、IL-6；去除骨骼附著的肌肉和結(jié)締組織，液氮冷存送檢,利用雙能X線骨密度儀分別測定全身BMD、股骨BMD及骨礦鹽含量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠骨代謝指標(biāo)水平變化

與NC組相比，IH組血清B-ALP水平升高(P<0.05),骨礦鹽含量水平顯著降低(P<0.01)，都有統(tǒng)計學(xué)差異。見表1。

組別nB-ALP(U/L)骨礦鹽含量(g)NC組10171.25±21.462.02±1.69IH組10200.40±49.41?0.47±0.04??

注：與NC組相比，*P<0.05，**P<0.01
Compared to NC group*P<0.05,**P<0.01

2.2 大鼠各部位BMD水平變化

與NC組相比，IH組全身BMD降低(P<0.05)，股骨BMD顯著降低(P<0.01)，差異都有統(tǒng)計學(xué)差異。見表2。

組別n全身BMD(g/cm2)股骨BMD(g/cm2)NC組100.214±0.0270.208±0.030IH組100.179±0.020?0.148±0.002??

注：與NC組相比，*P<0.05，**P<0.01
Compared to NC group*P<0.05,**P<0.01

2.3 大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)水平變化

與NC組相比，IH組SOD水平顯著降低(P<0.05)，MDA水平升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。見表3。

組別nSOD(U/ml)MDA(nmol/ml)NC組1067.37±6.485.16±0.31IH組1052.78±6.24?6.94±0.33??

注：與NC組相比，*P<0.05,**P<0.01
Compared to NC group*P<0.05,**P<0.01

2.4 大鼠血清炎癥反應(yīng)指標(biāo)水平變化

與NC組相比，IH組IL-6和TNF-α水平顯著升高(P<0.05)，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。見表4。

組別nIL-6(pg/ml)TNF-α(pg/ml)NC組10166.34±30.6558.16±10.12IH組10261.21±34.44?76.24±7.72??

注：與NC組相比，*P<0.05,**P<0.01
Compared to NC group*P<0.05,**P<0.01

OSAHS是最常見的呼吸睡眠呼吸疾病,多數(shù)患者存在肥胖或上呼吸道如鼻咽部位的狹窄,長期間歇性低氧引起低氧血癥和高碳酸血癥及睡眠結(jié)構(gòu)紊亂，進而使機體發(fā)生一系列病理生理改變和靶器官功能受損，如心血管系統(tǒng)受損、腦卒中、代謝綜合征、心理異常、情緒障礙等疾病,目前已引起臨床高度重視。大量研究表明，OSAHS引起的間歇低氧與高血壓、冠心病、糖尿病視網(wǎng)膜病變等都有良好的相關(guān)性[5]，金常娥[6]等研究顯示，OSAHS與骨質(zhì)疏松有良好的相關(guān)性。Utting JC等[7]的研究表明,長期低氧可以誘發(fā)機體骨代謝平衡失調(diào)，影響成骨細(xì)胞增殖和促進破骨細(xì)胞吸收,骨量降低,骨結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，進而繼發(fā)骨質(zhì)疏松癥。而間歇低氧/復(fù)氧可以誘導(dǎo)機體產(chǎn)生氧化應(yīng)激狀態(tài)和炎癥反應(yīng)，使機體發(fā)生一系列代謝紊亂，因此筆者猜測間歇低氧/復(fù)氧產(chǎn)生的氧化應(yīng)激狀態(tài)和炎癥反應(yīng)可能是造成OSAHS患者發(fā)生骨質(zhì)疏松的重要原因。

本研究通過建立大鼠間歇低氧/復(fù)氧模型,模擬OSAHS患者在睡眠呼吸過程中發(fā)生的間歇低氧/復(fù)氧過程,旨在探究慢性間歇低氧/復(fù)氧對骨代謝的影響和引起骨代謝變化的機制。結(jié)果表明,IH組大鼠全身BMD、股骨BMD和骨礦鹽含量顯著低于NC組，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),表明間歇低氧/復(fù)氧過程使大鼠骨代謝發(fā)生變化，增加了骨質(zhì)疏松的危險性,這和Kulak等[8]對于OSAHS患者的研究結(jié)果一致;IH組血清B-ALP高于NC組,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),證實了間歇低氧/復(fù)氧可以誘導(dǎo)SD大鼠骨代謝平衡失調(diào),破骨細(xì)胞吸收增強,成骨細(xì)胞活性降低，導(dǎo)致釋放血清B-ALP水平升高，和Htomiyama R等[9]研究結(jié)果一致。長期慢性間歇低氧/復(fù)氧過程，骨組織骨礦鹽含量流失,骨密度降低，進而出現(xiàn)骨質(zhì)疏松癥。

目前許多國內(nèi)外研究報道間歇低氧/復(fù)氧引起的氧化應(yīng)激狀態(tài)是OSAHS患者機體發(fā)生損傷的關(guān)鍵因素，長期間歇低氧/復(fù)氧使機體線粒體減少,導(dǎo)致活性氧自由基(ROS)在體內(nèi)堆積,同時引起氧化能力增強，抗氧化能力下降,氧化與抗氧化失衡[10],從而引起機體損傷。有研究顯示間歇低氧暴露后大鼠體內(nèi)炎性標(biāo)志物TNF-α、IL-6升高,抗氧化劑SOD和還原型谷胱甘肽(GSH)顯著降低[4],表明間歇低氧/復(fù)氧使機體氧化物堆積和抗氧化能力減弱,引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)。實驗結(jié)果顯示，IH組大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD水平顯著降低，MDA水平升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，炎癥反應(yīng)指標(biāo)IL-6和TNF-α水平顯著升高(P<0.05)，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義，這和上述研究結(jié)果一致，表明慢性間歇低氧/復(fù)氧大鼠體內(nèi)發(fā)生了氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。相關(guān)研究表明，氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)有一定相關(guān)性，OSAHS患者體內(nèi)含有大量ROS,ROS可以上調(diào)控制炎癥反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，引起炎癥因子和細(xì)胞毒性T細(xì)胞產(chǎn)生，TNF-α、IL-6、IL-8產(chǎn)生增加[11]。Yokoe等[12]表明,OSAHS患者體內(nèi)IL-6和hs-CRP(超敏C反應(yīng)蛋白)水平升高，且與間歇低氧/復(fù)氧呈正相關(guān)，持續(xù)正壓通氣治療有效。

綜上表明：慢性間歇低氧/復(fù)氧誘發(fā)機體產(chǎn)生的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)可能是機體骨代謝發(fā)生變化的重要機制。但是間歇低氧/復(fù)氧引發(fā)機體骨代謝機制相當(dāng)復(fù)雜,有期刊曾報道內(nèi)分泌失調(diào)如甲亢、甲減、糖尿病、絕經(jīng)等可引起機體骨代謝失衡、B-ALP和BMD發(fā)生變化，進而增加了骨質(zhì)疏松的危險性,因此對于間歇低氧/復(fù)氧誘發(fā)機體骨代謝的原因仍需進一步深入探究。

總之，間歇低氧/復(fù)氧大鼠體內(nèi)存在氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)可能是骨密度降低，骨量流失,發(fā)生骨質(zhì)疏松的重要機制,也可能是OSAHS患者體內(nèi)發(fā)生一系列代謝紊亂的基礎(chǔ)。通過干預(yù)OSAHS患者低氧狀態(tài)和炎癥反應(yīng),對OSAHS患者骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防和治療具有指導(dǎo)作用。