張麗媛 納青青 吳天秀 周滿如 李近 劉鈺瑜

1.廣東醫(yī)學院解剖學教研室，湛江 524023 2.廣東醫(yī)學院藥理學教研室，湛江 524023

糖尿病與冠心病、腫瘤是當前影響人類健康的三大非傳染性疾病，已成為全球性的衛(wèi)生問題。根據WHO的預測報告，到2030年時，全球會有4.39億人患有糖尿病，約占世界總人口的7.7%[1]。依賴胰島素的1型糖尿病是由免疫炎性T細胞通過直接或間接的方式選擇性損毀胰島β細胞導致的慢性自身免疫性疾病，多發(fā)于青少年。

早在1948年，Albright首先報道了血糖長期控制不良的糖尿病病人可以發(fā)生骨質疏松癥。目前的研究已經明確1型糖尿病能夠導致骨量減少，使骨折危險性增加，但還不清楚其導致骨量減少的進程，其作用機制也存在爭議[2]。目前大多數研究是針對中老年女性發(fā)生骨質疏松進行研究，較少研究青少年糖尿病性骨質疏松，且對該疾病的研究大多局限在某一選定時間點上，沒有對整個疾病進程的變化情況進行系統(tǒng)的研究分析。為了進一步研究1型糖尿病大鼠骨質疏松癥的發(fā)病機理和藥物對其的防治作用，我們迫切需要一個動物模型進行研究，所以，建立理想的動物模型至關重要。

1 材料與方法

1.1實驗材料與儀器

炭化鎢鋼刀(德國 LEICA 公司); LEICA2155 硬組織切片機 (德國 LEICA 公司); 低速鋸 (BuehlerLTD． USA); 數字化板(SummaSketchRIiplus); LEICAMP30 熒光顯微鏡及顯微照相機 (德國 LEICA 公司); LEICA QWN 半自動圖象分析儀(德國 LEICA公司);Micro-CT(SKYSCAN 1176)； AE240 電子天平(梅特勒-托利多儀器公司上海分公司); 游標卡尺(湛江市量具刃具廠); 電熱恒溫電烤箱(上海躍進醫(yī)療器械廠); IRIS/AP 電感偶合等離子體發(fā)射光譜儀(TJA，USA)。

1.2實驗動物與方法

SD大鼠60只，雄性，體質量(201±20) g，3 月齡，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供(動物合格證書編號: 2006A015)。將60只大鼠隨機分為模型組、對照組，每組30只。

1.3造模與處理

1型糖尿病大鼠模型制備：分別用常規(guī)飼料喂養(yǎng)1周，第1周末禁食12 h后，進行腹腔注射STZ60 mg/kg[3]，注射部位選擇在下腹部后1/3處避開中部膀胱。造模72 h后，以血糖≥17.6 mmol/L作為成模標準，其余未成模大鼠剔除實驗。兩組大鼠均正常飼養(yǎng)，保持合適的溫度和濕度，給予充足的飲水和食物，定期監(jiān)測血糖，保證模型的穩(wěn)定。實驗過程中通過活體MicroCT分析及三維結構重建，測得實驗組大鼠的骨密度值。采用隨機數字表法，分別于造模成功后1周、4周、8周、12周、16周各隨機選取6只糖尿病模型大鼠和周齡相匹配的6只對照組大鼠處死。選取大鼠稱重后，分別以1%的氯胺酮100 mg/kg腹腔注射行全身麻醉，留取所處死大鼠的股骨以備下一步實驗用。

1.4觀察指標

骨標本的制作及測量指標: 實驗結束后，用 3% 戊巴比妥鈉(1.5 mL/kg) 行腹腔注射麻醉后右心室徹底抽血處死(以減少骨髓中紅細胞，排除干擾，使骨片更易于觀察分析)。取大鼠左側股骨，剔干凈軟組織。左側脛骨用低速據沿額狀面鋸開干骺端，暴露骨髓腔，于脛骨上端 1 /3 處橫行鋸斷脛骨，此為脛骨上端。將余下的脛骨于脛骨和腓骨結合處橫向鋸開，作中段骨檢測。用 LEICA QWN 半自動圖象分析儀測定并根據公式計算骨小梁面積、骨小梁厚度、骨小梁數目及骨小梁分離度[4]。

2 統(tǒng)計學處理

數據均采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行處理，結果以“均數±標準差”表示，組內兩樣本均數比較采用獨立樣本的t檢驗，組間差異采用單因素方差分析的方法分析。

3 實驗結果

3.1造模后大鼠空腹血糖的變化情況 造模前對照組和造模組血糖無差異。造模后，模型組血糖遠遠高于正常組，并且在實驗進行期間，造模組的血糖一直維持在高位，說明本實驗造模成功。

表1 兩組大鼠不同時間血糖變化(mmol/l)Table 1 The change of blood glucose in rats of two groups (mmol/L)

注：與對照組相比，*P<0.05，ΔP<0.01
Compared to controls,*P<0.05,ΔP<0.01

3.2造模對大鼠體重變化的影響

對照組大鼠體重從第1周至第16周一直呈上升趨勢，，模型組大鼠的體重在各選定實踐點都低于對照組，但第1周差異無統(tǒng)計學意義，在第4周后模型組大鼠體重明顯低于對照組，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。同時觀察造模大鼠的一般情況，發(fā)現(xiàn)造模后大鼠明顯多飲多尿，結合大鼠體重變化，可以從癥狀上判定造模成功，見表2。

表2 兩組大鼠不同時間體重變化(g)Table 2 The change of body weight in rats of two groups (g).

注：與對照組相比，*P<0.05，ΔP<0.01
Compared to controls,*P<0.05,ΔP<0.01

3.3造模對大鼠股骨骨密度的影響

隨著大鼠年齡的增長，正常大鼠股骨骨密度無明顯變化，糖尿病大鼠股骨骨密度逐漸降低。與對照組相應時間點比較，模型組大鼠股骨骨密度明顯降低(P<0.05或P<0.01)，見表3。

表3 兩組大鼠不同時間股骨骨密度變化(g/cm3)Table 3 The change of BMD of the femur in rats of two groups (g/cm3).

注：與對照組相比，*P<0.05，ΔP<0.01
Compared to controls,*P<0.05,ΔP<0.01

3.4造模對大鼠形態(tài)計量學參數的影響

表4 兩組大鼠不同時間脛骨上端形態(tài)計量學參數比較Table 4 Comparison of histomorphometry parameters of the upper tibia between the two groups.

注：與對照組相比，*P<0.05，ΔP<0.01
Compared to controls,*P<0.05,ΔP<0.01

由表4可見，骨小梁面積于第1W即開始降低，此后持續(xù)降低，第4W降低達17.71%；于第4W-第8W間降低速度最快，幅度最大，達到48.09%。骨小梁厚度也是第1W即開始降低，此后持續(xù)降低，第4W降低達11.49%；于第4W-第8W間降低速度最快，幅度最大，達到48.91%。骨小梁數目降低較緩和，各個時間段下降的幅度差別不大。骨小梁分離度與第1W即開始增加，此后持續(xù)增加，第4W增加達13.17%；于第4W-第8W間增加速度最快，幅度最大，達到51.28%。

4 討論

近年來糖尿病患病人數激增，已經受到越來越多人的重視，逐漸成為研究的熱點?，F(xiàn)已明確I型糖尿病能夠導致骨量減少，骨折危險性增加，但是糖尿病性骨質疏松的發(fā)病機理還未得到最終闡明[5]，在糖尿病研究領域尋找比較接近人類糖尿病發(fā)病過程的動物模型，對于更深入闡明糖尿病性骨質疏松的發(fā)病機理及分子生物學機制具有重要的科學意義。

糖尿病模型制備的選擇：糖尿病動物模型有實驗性和自發(fā)性動物模型，自發(fā)性動物模型的應用價值很高，但由于價格昂貴，飼養(yǎng)條件要求嚴格和不易成模等原因得不到廣泛應用；實驗性動物模型的制備方法包括胰腺切除、藥物誘發(fā)、食物誘發(fā)等。其中藥物誘發(fā)由于操作簡單、價格低廉及成模率等優(yōu)點在糖尿病動物模型中應用最為廣泛，常用藥物為鏈脲佐菌素(STZ)。它是一種廣譜抗菌素,具有抗菌、抗腫瘤的性能和致糖尿病的副作用。STZ導致糖尿病的機制為[6]:STZ具有活撥的烴基結構,可以直接損傷胰島β細胞DNA,刺激其釋放H2O2,過量的H2O2及其轉化形成的烴自由基引起細胞DNA斷裂,增加脂質過氧化物水平,抑制胰島素的釋放[7]。有研究表明,STZ對破壞胰島β細胞具有高度特異性的毒性作用,造模成功后較穩(wěn)定,死亡率低。有研究指出,大鼠腹腔注射STZ成模率可達到90%,并：腹腔注射較尾靜脈注射操作簡單,準確快速,因此現(xiàn)多采用腹腔注射STZ法制作糖尿病模型。本研究結果發(fā)現(xiàn),糖尿病模型大鼠成模后,血糖值高于造模成的隨機血糖標準且較穩(wěn)定。通過統(tǒng)計學分析各時間點大鼠血糖變化,發(fā)現(xiàn)血糖變化起伏小。從而也證明了STZ確為造模效果明確、造模穩(wěn)定、成活率較高的胰島細胞破壞藥物?？傊?本研究認為一次大劑量STZ注射制備糖尿病模型的方法使用簡單,造模效果好,成活率高。

造模動物的選擇：常用于制作骨質疏松模型的動物油犬、羊、豬、大鼠、小鼠和兔等[8]，由于大鼠與人類骨骼的病例生理相似且比較經濟，所以，本研究采用大鼠制作1型糖尿病性骨質疏松動物模型。

造模動物種屬、性別的選擇：STZ誘發(fā)糖尿病的作用具有種屬差異性，wistar糖尿病鼠少數可自發(fā)緩解，但少見SD大鼠自發(fā)緩解的報道，提示SD大鼠可能優(yōu)于wistar鼠。此外有報道SD大鼠成模率也高于wistar鼠，但無顯著統(tǒng)計學意義[9]。綜合文獻報道，在本實驗中，我們選擇了SD大鼠。此外Mordes[10]等報道，選用雄性大鼠制備模型的成模率明顯高于雌性大鼠。故在本實驗中，我們選擇雄性大鼠。

造模動物年齡選擇：大鼠壽命一般為2～3年，3月齡的大鼠已達到性成熟，6月齡大鼠才能真正達到骨成熟，17月齡即進入老年時期。本實驗主要研究多發(fā)于青少年的1型糖尿病性骨質疏松，故選擇小于3月齡大鼠制作1型糖尿病模型是合適的，本實驗動物選擇的是6～8周的SD大鼠。為觀察成模的穩(wěn)定性，本實驗觀察了成模后16W各種指標的變化，結果顯示該模型穩(wěn)定性好。

骨質疏松模型的指標有骨密度、生物力學、骨組織形態(tài)、血清生化和尿生化，以及骨生成和吸收耦聯(lián)中分子的變化。而骨組織形態(tài)計量學是用定量的方法分析骨組織結構改變的測量技術，能精確地測量骨組織結構和總體骨量的變化，是描述骨小梁結構變化的有效指標，為骨質疏松提供病理學證據，可作為診斷骨質疏松依據。本實驗研究6-8周齡雄性大鼠1型糖尿病模型制備成功后，第1W開始骨量降低，第4W后發(fā)生急劇的下降，第8W已降低接近50%。1型糖尿病早期即開始出現(xiàn)骨質破壞，提示糖尿病性骨質疏松的預防和治療應從發(fā)病初期即開始進行。

綜上所述，利用一次大劑量STZ注射的方法，可以制備符合1型糖尿病特點的1型糖尿病大鼠模型，本研究從大鼠成模后第1W開始觀察其骨形態(tài)學的變化，連續(xù)觀察16W，揭示在糖尿病性骨質疏松癥發(fā)生和發(fā)展過程中骨骼變化的規(guī)律，為臨床預防和治療I型糖尿病性骨質疏松提供動物實驗依據。