余 倩 宋雙紅,2 李翠芹*

1.西北瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實(shí)驗(yàn)室/藥用資源與天然藥物化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710119 2.西北工業(yè)大學(xué)生命學(xué)院特殊環(huán)境生物物理學(xué)研究所，空間生物實(shí)驗(yàn)?zāi)M技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安710072

紅車軸草(TrifoliumpratenseL.)是一種多年生草本植物，屬于豆科車軸草屬，又名紅三葉草，其花序和花枝含有大量異黃酮成分，因其具有雌激素樣作用而備受關(guān)注[1]。研究表明紅車軸草總異黃酮具有改善婦女更年期癥狀和防治療骨質(zhì)疏松的作用[1-3]。本研究采用血清藥理學(xué)和體外培養(yǎng)MC3T3-E1成骨樣細(xì)胞的方法觀察含紅車軸草總異黃酮的大鼠血清對MC3T3-E1成骨樣細(xì)胞增殖、分化及礦化的影響，從細(xì)胞學(xué)水平探討紅車軸草總異黃酮促進(jìn)骨形成的作用機(jī)制，為紅車軸草總異黃酮治療骨質(zhì)疏松癥的研究提供一定的資料。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1動(dòng)物與細(xì)胞系：健康SD雌性大鼠32只，體重200±20 g，購自第四軍醫(yī)大學(xué)SPF動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物合格證號(hào)陜醫(yī)動(dòng)字08-014號(hào)。飼養(yǎng)條件：室溫24±2 ℃，相對濕度40%～70%，每日人工照明和黑暗處理各12 h，自由飲水，喂食顆粒飼料。MC3T3-E1成骨樣細(xì)胞系(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心)。

1.1.2藥物和試劑：紅車軸草總異黃酮(陜西慈緣生物技術(shù)有限公司，含量≥98.0%，批號(hào)為CY140415)；α-MEM培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)(Gibco公司)；維生素C、β-甘油磷酸鈉、噻唑蘭(MTT)和胰蛋白酶(Sigma公司)；堿性磷酸酶試劑盒(南京建成生物工程研究所)；骨鈣素(OC)測試盒(北京科盈美科技有限公司)；茜素紅(天津化學(xué)試劑廠)；鏈霉素、青霉素(華北制藥廠)；二甲亞砜(DMSO)(MP Biomedicals公司)，其余試劑均為分析純級(jí)。

1.1.3儀器：恒溫CO2培養(yǎng)箱(新加坡藝思高科技有限公司)，Infinite M200型多功能酶標(biāo)儀(奧地利Tecan公司)，倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，YJ-875型超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠)，離心機(jī)(江蘇牡丹離心機(jī)制造有限公司)，超低溫冰箱。

1.2 方法

1.2.1含藥血清的制備：32只雌性SD大鼠，隨機(jī)分成2組，一組為服藥組，按100 mg/kg灌服紅車軸草總異黃酮，每天1次，連續(xù)7 d。另一組為對照組，只灌服相同體積的生理鹽水。第7 d灌胃1.5 h后，所有大鼠均在乙醚麻醉下自腹主動(dòng)脈抽取血液，同組合并后于4℃靜置30 min，以2000×g、4℃離心20 min獲取紅車軸草總異黃酮含藥血清或?qū)φ昭?生理鹽水含藥血清)。血清在56℃滅活30 min， 0.22 μm 濾膜過濾除菌后，-80℃保存?zhèn)溆?，使用時(shí)注意避免反復(fù)凍融。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)：MC3T3-E1細(xì)胞復(fù)蘇后接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，以含10% FBS、1%配制好的雙抗的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，2 d換液1次，待細(xì)胞鋪滿80%瓶底后胰蛋白酶消化傳代，繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞再次鋪滿80%瓶底后胰蛋白酶消化，以不同的密度接種于96孔板或者24孔板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3細(xì)胞增殖測定：培養(yǎng)中的細(xì)胞鋪滿80%～90%瓶底后胰蛋白酶消化傳代，以2×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，每孔總體積200 μL。24 h后加入含不同濃度紅車軸草總異黃酮含藥血清的培養(yǎng)液，終濃度分別為2.5%、5%和10%，對照組加入含大鼠空白血清的培養(yǎng)液，終濃度分別為2.5%、5%和10%，調(diào)零組不含細(xì)胞和藥物，每組設(shè)置6個(gè)平行孔。24 h、48 h、72 h和96 h后向培養(yǎng)液中加入20 μL的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄培養(yǎng)液，每孔加入100 μL的DMSO，振蕩10 min以保證甲瓚全部溶解，酶標(biāo)儀570 nm處測定光光密度D(λ)值，計(jì)算細(xì)胞增殖率。

1.2.4堿性磷酸酶活性測定：培養(yǎng)中的細(xì)胞鋪滿80%～90%瓶底后胰蛋白酶消化傳代，以5×103/孔的密度接種于96孔板中，每孔總體積200 μL。待細(xì)胞鋪滿孔底后更換為含有維生素C和β-甘油磷酸鈉的誘導(dǎo)性培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的紅車軸草總異黃酮含藥血清，終濃度分別為2.5%、5%和10%，對照組加入含大鼠空白血清的培養(yǎng)液，終濃度分別為2.5%、5%和10%，調(diào)零組不含細(xì)胞和藥物，每組設(shè)置6個(gè)平行孔。每2 d換對應(yīng)的誘導(dǎo)性培養(yǎng)液，在第3 d和第6 d按照試劑盒說明書測定堿性磷酸酶的活性。

1.2.5骨鈣素含量的測定：培養(yǎng)中的細(xì)胞鋪滿80%～90%瓶底后胰蛋白酶消化傳代，以5×104/孔的密度接種于24孔板中，每孔總體積1 mL。待細(xì)胞鋪滿孔底后更換為含有維生素C和β-甘油磷酸鈉的誘導(dǎo)性培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組加入5%紅車軸草總異黃酮含藥血清，對照組加入5%空白大鼠血清，調(diào)零組不含細(xì)胞和藥物，每組設(shè)置3個(gè)平行孔。細(xì)胞誘導(dǎo)性培養(yǎng)后每3 d換1次培養(yǎng)液，每次換液保留1 mL舊培養(yǎng)液，于-20℃保存，連續(xù)收集第3 d、6 d、9 d、12 d 的樣品，采用ELISA法檢測骨鈣素的分泌量，以mg/L培養(yǎng)液表示。

1.2.6細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)量測定：培養(yǎng)中的細(xì)胞鋪滿80%～90%瓶底后胰蛋白酶消化傳代，以5×104/孔的密度接種于24孔板中，每孔總體積1 mL。待細(xì)胞鋪滿孔底后更換為含有維生素C和β-甘油磷酸鈉的誘導(dǎo)性培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組加入5%紅車軸草總異黃酮含藥血清，對照組加入5%空白大鼠血清，調(diào)零組不含細(xì)胞和藥物，每組設(shè)置3個(gè)平行孔。每2 d換對應(yīng)的誘導(dǎo)性培養(yǎng)液，在第6 d、12 d、18 d棄去培養(yǎng)液，PBS清洗3次后用70%的乙醇固定1 h，蒸餾水清洗3次，加入提前配制的40 mmol/L茜素紅染液(pH=4.2)于37℃孵育10 min，再用蒸餾水清洗3次，用PBS于37℃孵育10 min，鏡下觀察礦化結(jié)節(jié)并量化。

2 結(jié)果

2.1 紅車軸草總異黃酮含藥血清對MC3T3-E1細(xì)胞增殖的影響

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖1)表明：紅車軸草總異黃酮含藥血清各濃度組與對照組相比，作用于細(xì)胞48 h、72 h和96 h，均可顯著提高M(jìn)C3T3-E1成骨樣細(xì)胞的增殖率。

圖1 細(xì)胞增殖率檢測，與空白組比較(*P<0.05 vs control.)C: 對照組; L: 低濃度組(2.5%); M: 中濃度組(5%); H: 高濃度組(10%);Fig.1 Cell proliferation rate defection.compared with the controlC: control; L: low concentration group (2.5%); M: middle concentration group (5%); H: high concentration group (10%).

2.2 紅車軸草總異黃酮含藥血清對MC3T3-E1細(xì)胞分化的影響

堿性磷酸酶(ALP)活性測定實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖2)表明：與對照組相比，5%紅車軸草總異黃酮含藥血清作用于MC3T3-E1細(xì)胞3 d、6 d、9 d和12 d、均能顯著提高其堿性磷酸酶的活性。

圖2 相對ALP活性檢測，與空白組比較(*P<0.05 vs control.)C: 對照組; L: 低濃度組(2.5%); M: 中濃度組(5%); H: 高濃度組(10%)Fig.2 Detection of relative ALP activity.Compared with the control,(*p<0.05 vs control.).C: control; L: low concentration group (2.5%); M: middle concentration group (5%); H: high concentration group (10%)

2.3 紅車軸草總異黃酮含藥血清對MC3T3-E1細(xì)胞骨鈣素分泌的影響

ELISA法檢測骨鈣素的分泌量(圖3)表明：5%的紅車軸草總異黃酮含藥血清處理MC3T3-E1細(xì)胞6 d和9 d骨鈣素分泌量顯著高于對照組。

圖3 骨鈣素分泌檢測，與空白組比較(*P<0.05,**P<0.01 vs control.)C：大鼠空白血清對照組；TLES：紅車軸草總異黃酮含藥血清組Fig.3 Detection of osteocalcin level.Compared with the control,*P<0.05,**P<0.01 vs controlC: blank rat serum control group; TLES: serum containing the total isoflavones from t.Pratense group

2.4 紅車軸草總異黃酮含藥血清對MC3T3-E1細(xì)胞礦化的影響

茜素紅染色法測定結(jié)果(圖4)表明：5%紅車軸草總異黃酮含藥血清處理細(xì)胞6 d、12 d和18 d，形成的礦化結(jié)節(jié)數(shù)均顯著高于對照組。

圖4 A：第18 d顯微鏡下觀察的礦化結(jié)節(jié)(a：對照組4×；b：紅車軸草總異黃酮含藥血清組4×)；B：礦化結(jié)節(jié)面積的量化分析(*P<0.05 vs control.)C：大鼠空白血清對照組；TLES：紅車軸草總異黃酮含藥血清組Fig.4 Detection of relative mineralization.A: Images of mineralized nodules observed in microscope on D18.(a: control, 4×; b: serum, 4×).B: Quantitative analysis of the area of mineralization,*p<0.05 vs control.C: Blank rat serum group; TLES: serum containing the total isoflavones from t.Pratense group.

3 討論

骨重建是健康骨組織中的一個(gè)重要生理過程，其主要包括成骨細(xì)胞的骨生成過程和破骨細(xì)胞的骨吸收過程，若骨吸收過程大于骨生成，則就會(huì)形成骨質(zhì)疏松癥等疾病[4]，骨質(zhì)疏松癥是全球四大非傳染性致死疾病之一，直接導(dǎo)致患病人群的生活質(zhì)量下降和一定的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[5]。因此，篩選抗骨質(zhì)疏松癥藥物并在細(xì)胞學(xué)水平進(jìn)行藥效評價(jià)是非常必要的。

機(jī)體是一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)，骨代謝受多種因素的影響，藥物在體內(nèi)代謝可產(chǎn)生許多藥理活性產(chǎn)物，出現(xiàn)許多藥理作用。紅車軸草總異黃酮主要包括大豆苷元(daidzein)、染料木素(genistein)、鷹嘴豆芽素A(biochanin A)和鷹嘴豆芽素B(biochanin B)等。異黃酮類成分在肝臟與葡糖醛酸、硫酸結(jié)合后部分以原形排出體外。先前研究提示大豆苷元僅口服劑量的7%-30%從尿中排出和小于10%從糞便排出[6-7]，表明大豆苷元在體內(nèi)進(jìn)行廣泛代謝，除部分轉(zhuǎn)化牛尿酚(equol)和O-去甲基安哥拉紫檀素(O-desmethylangolensin)外，大豆苷元在肝微粒體中可發(fā)生羥化代謝，其中單羥基化代謝物為其主要代謝物[8-9]。另外，細(xì)菌也氧化部分異黃酮。因此，通過中藥血清藥理學(xué)的方法進(jìn)行研究有著更重要的意義。

成骨細(xì)胞起源于多能的骨髓基質(zhì)的間質(zhì)細(xì)胞，在骨形成過程中經(jīng)歷分裂增殖、分化成熟和基質(zhì)鈣化3個(gè)階段。MC3T3-E1細(xì)胞是從C57BL/6小鼠顱頂骨細(xì)胞中建立的成骨細(xì)胞株，國際上常作為骨代謝研究的細(xì)胞模型，在細(xì)胞水平上闡明藥物防治骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用紅車軸草總異黃酮含藥血清在細(xì)胞水平上以MC3T3-E1成骨細(xì)胞的增殖、堿性磷酸酶活性、骨鈣素生成以及礦化結(jié)節(jié)形成為指標(biāo)，觀察其對體外培養(yǎng)的MC3T3-E1成骨樣細(xì)胞的影響。結(jié)果顯示：不同濃度的紅車軸草總異黃酮含藥血清作用于細(xì)胞48 h、72 h和96 h，均可顯著提高M(jìn)C3T3-E1成骨樣細(xì)胞的增殖率(P<0.05)，并具有一定的時(shí)效關(guān)系，說明其具有促進(jìn)MC3T3-E1成骨樣細(xì)胞增殖的作用。

堿性磷酸酶和骨鈣素分別是成骨樣細(xì)胞早期和晚期分化的標(biāo)志，是最常見評價(jià)骨形成的指標(biāo)，與對照組相比，紅車軸草總異黃酮含藥血清各濃度組在作用6 d、9 d和12 d均能顯著提高堿性磷酸酶的活性(P<0.05)；而且，5%紅車軸草總異黃酮含藥血清可顯著性促進(jìn)成骨樣細(xì)胞的骨鈣素分泌，提示其能促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。

骨基質(zhì)的礦化對于骨量的增加是至關(guān)重要的。它不僅是成骨細(xì)胞的重要生物學(xué)特征，也是考察藥物對成骨細(xì)胞促成骨作用的最有效方式。5%紅車軸草總異黃酮含藥血清處理細(xì)胞6 d、12 d和18 d形成礦化結(jié)節(jié)數(shù)都顯著高于對照組，提示其能促進(jìn)成骨細(xì)胞礦化。

本實(shí)驗(yàn)從紅車軸草總異黃酮含藥血清對MC3T3-E1成骨樣細(xì)胞的增殖、堿性磷酸酶活性、骨鈣素以及礦化等四方面進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示紅車軸草總異黃酮含藥血清不僅可以增加MC3T3-E1成骨樣細(xì)胞的增殖率，提升堿性磷酸酶的活性，還可以促進(jìn)MC3T3-E1成骨樣細(xì)胞的骨鈣素分泌，進(jìn)而提高成骨樣細(xì)胞的礦化水平。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞水平觀察了紅車軸草總異黃酮含藥血清對MC3T3-E1成骨樣細(xì)胞代謝調(diào)控的影響，發(fā)現(xiàn)其具有促進(jìn)MC3T3-E1成骨樣細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞分化成熟、以及促進(jìn)細(xì)胞礦化的作用，從而為紅車軸草總異黃酮應(yīng)用于臨床治療骨質(zhì)疏松癥提供了理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。