楚佳奇 孫杰聰 李鵬 李廣盛 牛艷茹 林顥 陳光華 魏波 魏勁松 曾榮*

1. 廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院骨科中心，湛江 524001 2. 廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院干細胞研發(fā)與細胞治療中心，湛江 524001

骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis，OP)是一種以全身低骨量和骨組織微結(jié)構(gòu)改變、破壞為特征，能導致骨脆性增加，骨折風險性增高的全身疾病。骨質(zhì)疏松性骨折(Osteoporosis fracture，OPF)是OP最嚴重的并發(fā)癥之一，其發(fā)生、致死致殘率較高，且OPF多為粉碎性，骨強度低，愈合慢，抗再骨折能力差，易發(fā)生內(nèi)固定松動和再骨折。因此尋求一種更為之有效的治療方法是眾多臨床及科研工作者的迫切目標。富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)中含有大量生長因子，可加快骨細胞活化，促進骨細胞增殖、血管再生，誘導骨再生，促進骨缺損修復[1, 2]。我們在前期的體外實驗中已經(jīng)證實，相對于單純成骨誘導，PRP輔助誘導的人臍帶間充質(zhì)干細胞(Human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)成骨效果更佳。

本實驗擬建立SD(Sprague Dawley)大鼠OPF模型并對其進行細胞移植，通過Micro CT動態(tài)觀察探討PRP及hUC-MSCs對動物模型骨折愈合的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雌性SPF(Specefic pathogen Free)級SD大鼠50只，3月齡，體重250±17 g(購自廣東醫(yī)學院實驗動物中心)。

1.2 主要材料與試劑

人臍帶間充質(zhì)干細胞(P3代)由廣東省臍帶血造血干細胞庫提供，低糖L-DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(GIBCO，美國)，成骨誘導培養(yǎng)基(廣州賽業(yè)生物科技有限公司)，7%水合氯醛，常規(guī)手術(shù)器械，動物固定臺架，注射器，法國Osteospace MEDI LINK雙能X線骨密度檢測儀，規(guī)格1.0×250 mm骨牽引針20支(張家港市?？滇t(yī)療器械有限公司)，克氏針截斷器，骨科電鉆，骨折模型打擊支架[3]，SCANCO MEDICAL Micro CT (viva CT40)，NIKON D90數(shù)碼相機。

1.3 PRP制備及成骨誘導

知情同意情況下，無菌采取足月孕產(chǎn)婦臍帶血50 ml(預先加入10%枸櫞酸鈉抗凝劑)，第1次460 g室溫離心8 min，超凈臺內(nèi)吸取上層血漿及白膜層細胞，盡量去除紅細胞；第2次1100 g室溫離心10 min，去除約3/4上清及底層少許紅細胞，剩下中間層約1 ml即為PRP，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

P5代hUC-MSCs接種于6孔板，待細胞80%融合時加入成骨誘導培養(yǎng)基，每3天換液1次，培養(yǎng)至21天時進行茜素紅染色鑒定。

1.4 制作大鼠OPF模型

SD大鼠購回后適應性飼養(yǎng)1周，正常飲食，籠中飼養(yǎng)，自由活動。根據(jù)隨機數(shù)字表，將50只SD

大鼠隨機分為假手術(shù)組10只，手術(shù)組40只，手術(shù)組又分為：安慰劑組、未誘導組、成骨誘導組、PRP+成骨誘導組，每組10只。術(shù)前采用雙能X線骨密度檢測儀對大鼠股骨遠端進行骨密度(Bone mineral density，BMD)檢測。大鼠麻醉后，手術(shù)組切除雙側(cè)卵巢，假手術(shù)組切除相同體積的卵巢周圍組織。術(shù)后將大鼠分籠飼養(yǎng)，允許其自由活動。各組大鼠手術(shù)后3個月再次以同樣方法，同樣參數(shù)測定骨密度。確定骨質(zhì)疏松造模成功后，參照前人方法進行OPF造模[4]。

1.5 細胞移植及動態(tài)觀察OPF愈合

P5代細胞成骨誘導7天后消化，生理鹽水重懸，細胞濃度調(diào)整為2×106/ml，移植0.5 ml細胞于動物骨折部位。細胞移植共進行3次，時間點選為OPF模型建立后1周、3周和7周。安慰劑組直接注射生理鹽水，未誘導組給予未誘導的hUC-MSCs，成骨誘導組移植誘導后的hUC-MSCs，PRP+成骨誘導組移植誘導后的hUC-MSCs聯(lián)合PRP(含TGF-β1 750 pg/ml)[5]。

骨折后的第1周、3周、5周、7周、11周、13周進行Micro CT掃描動物模型患肢。Micro CT掃描參數(shù)設置如下：X線能量70 kVp，114μA，8W，掃描模式BH：ALU，掃描分辨率0.038 mm，曝光時間200ms。以HP圖像采集工作站及μCT Tomography(V6.1-2)圖像采集分析系統(tǒng)進行三維重建。計算骨體積分數(shù)(Bone volume/Total volume，BV/TV)，以SPSS 17.0 做單因素ANOVA分析，P<0.05有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 細胞培養(yǎng)及成骨誘導

倒置顯微鏡下觀察P5代hUC-MSCs，接種12小時后80%左右細胞均已貼壁生長，呈梭形。接種后第二天細胞約有80%融合。hUC-MSCs經(jīng)成骨誘導培養(yǎng)21 d，茜素紅染色可見間質(zhì)內(nèi)含大量礦鹽沉積的鈣化結(jié)節(jié)呈紅色。

圖1 光鏡下細胞生長及成骨誘導后茜素紅染色鑒定(40×)。 a，接種后12小時80%細胞貼壁；b，接種后24小時，細胞生長融合約80%；c，成骨誘導后21天茜素紅染色，箭頭所示為被染紅的鈣結(jié)節(jié)Fig.1 The morphology of cell growth and alizarin red staining after osteogenic induction (40×). a, There were 80% adherent cells at 12 h post-inoculation；b,Cells were grown to confluence about 80% 24 h post-seeding；c, Alizarin red staining was performed after osteogenic induction for 21 d, calcium nodules were marked with red arrows

2.2 骨密度檢測

采用MEDI LINK雙能X線骨密度檢測儀進行骨密度掃描后分析數(shù)據(jù)：假手術(shù)組術(shù)前術(shù)后樣本均數(shù)及標準差分別為0.222±0.071和0.238±0.068，P>0.05，差異無統(tǒng)計學意義；其它4個手術(shù)組術(shù)前術(shù)后骨密度均有不同程度降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，提示骨質(zhì)疏松造模成功(表1)。

表1 假手術(shù)組，手術(shù)組術(shù)前術(shù)后樣本BMD均數(shù)比較(g/cm2)Table 1 Comparison of BMD before and after operation in sham and operation group(g/cm2)

注：*假手術(shù)組術(shù)前與術(shù)后BMD比較，P>0.05；**手術(shù)組術(shù)前與術(shù)后BMD比較，P<0.01。*Comparison of BMD before and after operation in sham operation group，P>0.05；**Comparison of BMD before and after operation in operation group，P<0.01.

2.3 OPF造模

骨折術(shù)后行Micro CT觀察OPF造模情況(圖2)。內(nèi)固定過程中， 39支克氏針正常通過大鼠股骨骨髓腔，X線攝片骨折線清晰可見。另外1只動物克氏針于股骨中下1/3處穿出骨髓腔，與股骨并行，造模失??； 1只動物進行骨折打擊時擊中股骨血管神經(jīng)束，造成大量出血，動物死亡，造模失??； 1只動物術(shù)后第二天不明原因死亡，造模失敗。總體造模成功率達92.5%。

圖2 OPF造模后X線攝片觀察。箭頭所指為骨折斷端。Fig.2 X-ray images of OPF model. The fracture area was marked with arrow

2.4 Micro CT動態(tài)觀察OPF愈合

安慰劑組：在骨折后第13周骨痂仍未對骨折端形成有效包裹，與PRP+成骨誘導組第7周時的骨痂包裹量相仿(圖3)；

未誘導組：骨折后第11骨痂包裹與成骨誘導組無明顯區(qū)別，優(yōu)于安慰劑組，13周時，骨痂量、包裹程度與成骨誘導組相仿(圖3)；

成骨誘導組：第3、7周骨痂量與安慰劑組、未誘導組無明顯區(qū)別，少于PRP+成骨誘導組，骨折后第11周骨痂尚未形成完全包裹，第13周時，骨折端雖被骨痂包裹，但愈合程度不及PRP+成骨誘導組(圖3)；

PRP+成骨誘導組：在骨折后第3周重建即可見在骨折部位附近有少量骨痂生長，第7周時骨痂在骨折端的包裹明顯優(yōu)于其他組，骨折線逐漸消失；第11周時，骨痂已明顯包裹骨折部位，提示進入骨折塑形期。(圖3)。

圖3 Micro CT 動態(tài)觀察骨折愈合情況Fig.3 Fracture healing was monitored using Micro CT

2.5 Micro CT 動態(tài)監(jiān)測骨體積分數(shù)

利用GraphPad Prism 5.0，以掃描時間點為橫坐標，BV/TV值為縱坐標作圖，可見PRP+成骨誘導組骨體積分數(shù)在各時間點明顯高于其它三組(圖4)。利用SPSS 17.0進行統(tǒng)計分析，結(jié)果表明在各個時間點安慰劑組與未誘導組差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，PRP+成骨誘導組各個觀察周期BV/TV值均高于其他各組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，成骨誘導組3、7、11周BV/TV值高于未誘導組與安慰劑組，低于PRP+成骨誘導組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

圖4 Micro CT 動態(tài)觀察BV/TV值變化情況Fig.4 BV/TV value was analyzed using Micro CT

3 討論

PRP富含多種生長因子，其中轉(zhuǎn)化生長因子β(Transforming growth factor β，TGF-β)是參與創(chuàng)傷、促進成骨的重要成分之一。TGF-β可促進前成骨細胞趨化和有絲分裂，增進膠原基質(zhì)合成，同時抑制破骨細胞生成和骨吸收，從而對創(chuàng)傷愈合和骨組織再生起促進作用[1, 2, 6]。在移植骨和骨松質(zhì)內(nèi)許多細胞膜上存在著TGF-β等因子受體，如成骨細胞和前成骨細胞，當加入PRP后，高質(zhì)量分數(shù)的生長因子加快了這些細胞的活化。前人研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1含量為750 pg/ml的PRP對誘導干細胞增殖、分化作用顯著，因此本實驗采用此濃度的PRP對細胞進行處理[5]。

hUC-MSCs在體外誘導條件下具有向成骨細胞定向分化的潛能，相對其它成體干細胞，來源更豐富，臨床取材方便，分離純度更高，具有強大的增殖與自我更新能力，免疫原性較低，蘊藏著比骨髓間充質(zhì)干細胞更加優(yōu)越的臨床應用價值[7, 8]，目前已廣泛應用于脊髓神經(jīng)損傷、心肌梗死、軟骨組織缺損等領(lǐng)域的臨床應用與實驗研究[9, 10]。

OP患者常伴隨骨密度降低，骨強度減弱，骨折風險增加[11]。OPF的常發(fā)部位是腰椎、股骨頸等[12]。目前已有眾多藥物投入到臨床中用以OPF的治療，如雌激素類、雙膦酸鹽類、降鈣素及鈣制劑等，雖有療效，但往往存在著較大副作用，并且可能會影響骨組織礦化以及骨折愈合。通常情況下，OPF比正常骨量的骨折更難愈合。正常中年大鼠的股骨骨折一般在第8周即可形成完全包裹的骨痂，進入骨痂重塑期。本實驗我們以OPF大鼠模型作為研究對象，將PRP聯(lián)合hUC-MSCs分三次移植骨折部位，采用Micro CT動態(tài)觀察愈合效果，結(jié)果顯示， PRP+成骨誘導組在第11周開始即進入骨痂重塑期，而其他組別骨痂重塑期更加滯后，比正常骨量大鼠愈合時間至少推遲了37.5%。

骨體積分數(shù)(BV/TV)是Micro CT掃描結(jié)果中的重要參數(shù)，它反應了重建范圍內(nèi)骨量與整個骨組織的比值，通過BV/TV能觀察到不同時期骨量變化。正常骨折愈合過程主要分為3個階段：血腫機化期，原始骨痂形成期，骨痂改造期，在這三個階段中，BV/TV值呈上升趨勢。崔燎等在對小鼠骨折進行治療過程中采用Micro CT監(jiān)測到隨時間增加BV/TV值升高[13]。本實驗中，我們觀察到各組大鼠的骨折部位在血腫機化期和原始骨痂形成期BV/TV呈上升趨勢，但在進入骨痂改造期后呈下降趨勢。這可能與動物模型有關(guān)：因OP會導致雌激素分泌不足，破骨細胞活躍程度提高，在骨痂重建期相對于骨形成，骨吸收占優(yōu)勢，致使BV/TV的下降超過正常水平。

綜上所述，PRP聯(lián)合hUC-MSCs移植可促進OPF愈合，但愈合的骨組織骨體積分數(shù)并未提高，尚存在較大的再次骨折風險，如何提高骨體積分數(shù)，從根本上治療OPF，還有待進一步研究。