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        針刺對SAMP10鼠大腦皮層脂筏磷脂組成及膽固醇含量的影響

        2016-07-30 04:10:23陳付艷聶坤于建春韓景獻天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院天津30093天津中醫(yī)藥大學天津30093
        上海針灸雜志 2016年2期
        關(guān)鍵詞:針法磷脂百分比

        陳付艷,聶坤,于建春,韓景獻(.天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院,天津 30093;2.天津中醫(yī)藥大學,天津 30093)

        ·動物實驗·

        針刺對SAMP10鼠大腦皮層脂筏磷脂組成及膽固醇含量的影響

        陳付艷1,2,聶坤1,于建春1,韓景獻1
        (1.天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院,天津 300193;2.天津中醫(yī)藥大學,天津 300193)

        目的觀察針刺對快速老化癡呆鼠SAMP10脂筏磷脂組成及膽固醇含量的影響,并探討針刺改善癡呆的機制。方法以快速老化癡呆鼠SAMP10和正常老化鼠SAMR1為模型,隨機分為R1對照組、P10針刺組、P10非穴組、P10對照組,通過Mor ris水迷宮隱蔽平臺試驗檢測小鼠的學習記憶能力,采用蔗糖密度梯度超速離心法分離脂筏,液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(LC/MS)測定脂筏中磷脂組成,比色法測定脂筏膽固醇含量。結(jié)果P10對照組與R1對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),逃避潛伏期明顯延長;P10針刺組與P10對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),逃避潛伏期明顯縮短;P10針刺組與R1對照組比較,第1~3天有顯著性差異(P<0.05),第4、5天與R1對照組比無顯著性差異(P>0.05);P10非穴組與P10對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。SAM鼠大腦皮層脂筏磷脂含有磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰絲氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰甘油(PG)5類磷脂組分;SAMP10脂筏磷脂中PI、PS、PC相對百分比升高,PG、PE相對百分比降低,針刺后PG、PE相對百分比降低,PI、PS、PC相對百分比升高;P10對照組脂筏膽固醇含量比R1對照組少(P<0.05);與P10對照組比較,P10針刺組有顯著性差異(P<0.05),脂筏膽固醇含量增加,并趨向于R1對照組;P10對照組與P10非穴組無顯著性差異(P>0.05)。結(jié)論調(diào)節(jié)脂筏膽固醇含量可能是“三焦”針法改善SAMP10鼠癡呆狀況的機制之一。

        針刺;快速老化小鼠P10;脂筏;膽固醇;磷脂類

        [Abstract]ObjectiveTo investigate the effect of acupuncture on phospholipid com position and cholesterol content of lipid rafts in the cerebral cortex of SAMP10 m ice with rapid aging dementia and exp lore themechanism of acupuncture for alleviating dementia.M ethodSAMP10 m ice with rapid aging dementia and SAMR1 m ice with normal aging w ere used as themodel and random ized into R1 control,P10 acupuncture,P10 non-acupoint and P10 control groups.Mouse learning and memory abilitieswere tested by a hidden platform in the Morris water maze.Lipid rafts w ere separated by sucrose density gradient centrifugation.The phospholipid com position of lipid rafts w as determ ined by liquid chromatography/mass spectrometry(LC/MS).The cholesterol content of lipid rafts w asmeasured by colorimetry.Resu ltEscape latency lengthened marked ly in P10 control group compared with R1 control group and there w as a statistically significant difference(P<0.05).Escape latency shortened markedly in P10 acupuncture group compared with P10 control group and there w as a statistically significant difference(P<0.05).There w as a significant difference between P10 acupuncture and R1 controlgroups at day 1 to 3(P<0.05)and no significant difference at day 4 to 5(P>0.05).There w as no significant difference betw een P10 non-acupoint and P10 control groups(P>0.05).Lipid rafts in the cerebral cortex of SAM m ice contain five kinds of phospholipid com position:phosphatidylcholine(PC),phosphatidy lethanolam ine (PE),phosphatidy lserine(PS),phosphatidylinositol(PI)and phosphatidylglycerol(PG).Of lipid rafts in SAMP10 m ice,the relative percentage of PI,PS and PC was high and the relative percentage of PG and PE w as low.The relative percentage of PG and PE decreased and the relative percentage of PI,PS and PC increased after acupuncture.The cholesterol content of lipid rafts decreased in P10 control group com pared with R1 control group and there w as a statistically significant difference betw een the two groups(P<0.05).The cholesterol content of lipid rafts increased in P10 acupunctue group com pared with P10 control group and there was a statistically significant difference(P<0.05).It tended to be the same as in R1 control group.There w as no statistically significant difference betw een P10 control and P10 non-acupoint groups(P>0.05).ConclusionRegulating the cholesterol content of lipid rafts may be one of the mechanism s of“supplementing qi,regulating blood,consolidating the constitution and reinforcing the kidney”acupuncture for im proving dementia symptom s in SAMP10m ice.

        [Keywords]Acupuncture;P10m icewith rapid aging;Lipid rafts;Cholesterol;Phospholipids

        老年性癡呆(AD)發(fā)病率高,不僅給患者本人帶來極大痛苦,也給社會和家庭帶來沉重負擔。因此,對AD的研究成了醫(yī)學界的重要研究課題。近年來,有關(guān)脂筏的作用越來越引起學者的重視,研究其組分的變化與疾病的關(guān)系也越來越成為一個熱門課題。研究顯示[1],AD與脂筏功能紊亂有著密切的聯(lián)系。脂筏(lipid raf ts)膽固醇具有維持脂筏結(jié)構(gòu)和功能狀態(tài)的重要作用[2],脂筏各種磷脂成分之間比例的變化及磷脂分子所含脂肪酸種類的變化與腦功能有關(guān)。本研究選用快速老化癡呆鼠SAMP10為研究對象,以正常老化鼠SAMR1作為對照,觀察“三焦”針法(“益氣調(diào)血,扶本培元”針法)對SAMP10鼠脂筏膽固醇含量及磷脂組成的影響,旨在探討小鼠學習記憶能力的差異與脂筏膽固醇含量及磷脂組成的關(guān)系,為研究針刺改善AD的機制提供新的思路。

        1 材料與方法

        1.1動物選擇及分組

        選用20只7月齡正常老化鼠SAMR1和60只7月齡快速老化癡呆鼠SAMP10(津?qū)崉淤|(zhì)M準字第006號),雌雄各半,體重(27±3)g。隨機分為R1對照組、P10針刺組、P10非穴組、P10對照組,每組20只,雌雄各半。

        1.2穴位選擇和針刺方法

        針刺組采用“三焦”針法,穴位定位參考《實驗針灸學》(十五規(guī)劃教材)[3]中的動物穴位圖譜及文獻[4],取膻中、中脘、氣海及雙側(cè)血海、足三里。膻中、中脘、氣海及雙側(cè)足三里均行捻轉(zhuǎn)補法30 s,血海穴行捻轉(zhuǎn)瀉法30 s。非穴組行平補平瀉捻轉(zhuǎn)手法各30 s,取雙側(cè)脅下固定非經(jīng)非穴點(雙脅下髂嵴上10 mm)。R1和P10對照組進行與前兩組相同時間和程度的捉抓刺激。各組做相應(yīng)處理1個月,每天1次,第7天暫停1次。

        1.3Morr is水迷宮

        體育適性課堂教學應(yīng)在教師的指導(dǎo)下,以學生為主,設(shè)置合適的、能突破重難點的、能激發(fā)學生學習興趣的問題串,從而運用“一二·三六”教學模式探索實踐技能來完成整個學習過程。

        針刺結(jié)束后,各組小鼠進行5 d Mor r is水迷宮隱蔽平臺試驗[4],以評價針刺對SAMP10小鼠學習記憶能

        力的影響。直徑90 cm的水池平分成4個象限(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ),試驗時平臺在水面以下2 cm左右,位于Ⅰ象限的正中央,位置保持不動。每天分別于8:00和14:00各訓(xùn)練1次,分別記錄小鼠從池壁上Ⅱ、Ⅳ象限的中點入水至找到平臺的時間(逃避潛伏期)及游泳路線長度。后將小鼠置于平臺上休息10 s。如果90 s內(nèi)找不到平臺,潛伏期記為90 s。以兩次潛伏期的算術(shù)均值作為這一天的成績。

        1.4脂筏磷脂和膽固醇的檢測

        1.4.1提取脂筏

        水迷宮實驗結(jié)束后各組動物同時行頸椎脫臼法處死,剝?nèi)〈竽X皮層,依照蔗糖密度梯度超速離心法提取脂筏,加入1 mL 1%Tri tonX-100裂解液緩沖液懸浮細胞,冰上玻璃勻漿器中勻漿,搖勻,放進4℃冰箱靜置90 min,使充分裂解。再放進低溫離心機離心15 min。抽取上層細胞裂解物,向下層細胞裂解物中加入1%Tr itonX-100裂解液緩沖液使其體積和第一次加完裂解液后相同,重復(fù)以上勻漿、靜置、離心、抽提步驟。將兩次抽提的上層細胞裂解物混合后放入離心管底部,加入相同體積的80%蔗糖溶液,用漩渦混勻器混勻,再沿離心管壁緩慢加入30%蔗糖液5mL,用5%的蔗糖溶液將離心管加滿。4℃,超速離心20 h,320000×g。離心結(jié)束后,用注射器抽取離心管5%蔗糖和30%蔗糖交界面處一層不溶性絮狀白色沉淀,加入Tr iz-NaClbuf fer液漂洗,離心機離心,轉(zhuǎn)速10000×g,15 min。用注射器抽棄上層清洗液,留下下層沉淀即為脂筏。將相同組別的皮層所得脂筏合并在一只試管中。以上所有步驟均在0~4℃下進行[5]。

        1.4.2液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(LC/MS)測定脂筏磷脂

        從上述各組所提脂筏中各取出相同體積的脂筏依次置于標記好的空白試管中。提脂方法同文獻[6]所述。過濾樣品。

        采用正相硅膠色譜柱(250 mm×4.6 mm)進行梯度洗脫分離,總計洗脫時間60 min。正相色譜流動相梯度,5 min 5%~15%流動相B(氯仿:甲醇:氫氧化銨:水=60:36.5:0.5:3),3 min 15%流動相B,25 min 15%~60%流動相B,10 min 60%流動相B,5 min 60%~5%流動相B,12 min 5%流動相B。質(zhì)譜條件,采用電噴霧電離(ESI),噴霧電壓4.8 kV,霧化氣(N2)流量40個任意值單位(arb uni t),輔助氣(N2)流量7個任意值單位(arb unit),離子傳輸毛細管溫度300℃;全掃描范圍為500~1400 m/z;進行負離子檢測。

        磷脂測定實驗數(shù)據(jù)的計算,對單個離子峰面積與相應(yīng)的內(nèi)標物進行比較得到提取液中各磷脂分子的量,具體公式為,提取液中各磷脂分子的量(ppm)=[待測磷脂峰面積/內(nèi)標物峰面積]×2.5,再計算各磷脂分子的量所占的相對百分比。

        1.4.3比色法測定脂筏膽固醇

        從上述所提脂筏中各取出20mL依次置于空白試管中。相同組別的做10支平行實驗。提脂,晾干。配制膽固醇標準工作液梯度液,參照Folch法[7]和比色法繪制標準曲線,用紫外分光光度計測定各試管所提脂中膽固醇在550納米處光吸收值,根據(jù)標準曲線計算樣品中膽固醇濃度即可,方法同文獻[6]所述。

        1.5統(tǒng)計學方法

        所有數(shù)據(jù)采用SPSS18.0軟件進行統(tǒng)計學處理,計量資料用均數(shù)±標準差表示,水迷宮數(shù)據(jù)分別以4個不同的處理組和不同的訓(xùn)練天數(shù)作為組間和組內(nèi)因素,采用雙因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

        2 結(jié)果

        2.1針刺對學習記憶功能的影響

        結(jié)果提示,P10對照組與R1對照組比較,兩者有顯著性差異(P<0.05),逃避潛伏期明顯延長,說明P10對照組學習獲取能力較正常R1對照組明顯降低,P10的學習獲取能力有較明顯的損害。P10針刺組與P10對照組比較,有顯著性差異(P<0.05),逃避潛伏期明顯縮短;與R1對照組比較,第1~3天有顯著性差異(P <0.05),說明P10針刺組逃避潛伏期較長,第4、5天與R1對照組比無顯著性差異(P>0.05),基本一致,說明針刺可改善SAMP10空間學習記憶的獲取能力,使之趨向于正常小鼠,針刺后P10的學習成績每天均有明顯提高。P10非穴組與P10對照組比較,無顯著性差異(P>0.05),說明非穴刺激沒有明顯改善SAMP10小鼠空間學習記憶的獲取能力。詳見表1。

        表1 各組隱蔽平臺試驗測試結(jié)果比較(±s,s)

        表1 各組隱蔽平臺試驗測試結(jié)果比較(±s,s)

        注:與R1對照組比較1)P<0.05;與P10對照組比較2)P<0.05

        組別 n 1 d 2 d 3 d 4 d 5 d R1對照組 20 67.39±15.00 49.90±10.29 38.23±11.35 31.71±11.42 29.34±12.62 P10對照組 20 84.27±12.501) 69.12±17.851) 55.22±24.411) 64.37±11.131) 64.79±14.621)P10針刺組 20 77.23±16.291)2) 55.46±10.261)2) 54.53±17.991)2) 32.10±9.422) 28.47±13.482)P10非穴組 20 79.30±9.15 76.85±10.68 65.36±17.12 54.21±5.89 52.41±9.37

        2.2針刺對脂筏磷脂組成的影響

        在同一分析條件下,與磷脂標準品對照,可鑒定出SAM鼠大腦皮層脂筏磷脂含有磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰絲氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰甘油(PG)5個磷脂組分。各磷脂組分的相對百分比見表2??梢钥闯?SAMP10鼠大腦皮層脂筏磷脂以PE、PC為主,共占總磷脂的87.27%,其中PC在總磷脂中的比例最高。與SAMR1相比,SAMP10脂筏磷脂中PI、PS、PC相對百分比升高,PG、PE相對百分比降低。針刺后PG、PE相對百分比降低,PI、PS、PC相對百分比升高。詳見表2。

        表2各組磷脂組分相對百分比 (%)

        SAMP10脂筏磷脂中含不飽和脂肪酸鏈的磷脂所占相對百分比與SAMR1相比無明顯區(qū)別,P10針刺組及P10非穴組增高,P10針刺組比P10非穴組變化更明顯。PG中含不飽和脂肪酸鏈的磷脂相對百分比增高,P10針刺組及P10非穴組增高,P10非穴組比P10針刺組變化更明顯;PE中含不飽和脂肪酸鏈的磷脂相對百分比降低,P10針刺組及P10非穴組升高,P10針刺組比P10非穴組變化更明顯;PI中含不飽和脂肪酸鏈的磷脂相對百分比增加,P10針刺組及P10非穴組使之降低,P10針刺組更趨向于R1;PC中含不飽和脂肪酸鏈的磷脂相對百分比增加,P10針刺組及P10非穴組增高,P10針刺組比P10非穴組變化更明顯。PS中含不飽和脂肪酸鏈的磷脂相對百分比4組之間差別不明顯。詳見表3。

        表3 含不飽和脂肪酸鏈的磷脂在各磷脂組分中的相對百分比 (%)

        2.3針刺對脂筏膽固醇含量的影響

        P10對照組與R1對照組比較有顯著性差異(P<0.05),脂筏膽固醇含量比R1膽固醇含量少。針刺后P10針刺組與P10對照組比較有顯著性差異(P<0.05),脂筏膽固醇含量增加,并趨向于R1對照組;P10非穴組與P10對照組比較無顯著性差異(P>0.05)。詳見表4。

        表4各組膽固醇濃度比較 (±s,g/L)

        表4各組膽固醇濃度比較 (±s,g/L)

        注:與R1對照組比較1)P<0.05;與P10對照組比較2)P<0.05

        組別 n  膽固醇濃度R1對照組 10 7.974±1.20 P10對照組 10 6.492±0.791)P10針刺組 10 7.73±2.292)P10非穴組 10 6.391±0.85

        3 討論

        中醫(yī)學理論認為,三焦是體液運行之徑,有宣通氣血津液、腐熟水谷、通調(diào)水道的作用。老年脂代謝異常屬中醫(yī)學“痰濁”范疇。痰濁為水谷津液運化失常所致,是臟腑功能失調(diào),氣血失和的表現(xiàn)。因此,要防治痰濁就必須調(diào)理水液代謝功能,要維持脂質(zhì)代謝的平衡就需要三焦氣化功能正常。韓景獻教授提出“三焦氣化失司”導(dǎo)致老年性癡呆論,從而確立了“三焦”針法[8],諸穴合用可調(diào)補上中下三焦之氣,活血化瘀,共奏“氣行則血行、血行則水行”之功,以蠲化痰濁,并調(diào)整五臟六腑之虛實。該針法能增加海馬脂筏募集的激酶類信號蛋白數(shù)量[9],同步增加神經(jīng)元細胞小G蛋白分子和骨架相關(guān)蛋白[10];在臨床治療老年性癡呆中也取得了較好的療效[11],并能提高老年人認知相關(guān)腦區(qū)葡萄糖代謝[12]。

        脂筏是一種富含膽固醇、鞘(磷)脂和蛋白質(zhì)的微結(jié)構(gòu)域,不溶于非離子去污劑,是細胞膜的功能結(jié)構(gòu)域[13-14]。SAMP10脂筏不僅存在磷脂組分異常,而且存在膽固醇代謝障礙,表現(xiàn)為脂筏各磷脂成分之間比例及磷脂中含不飽和脂肪酸鏈的磷脂的比例發(fā)生了變化,脂筏膽固醇含量下降。脂筏膽固醇和磷脂都參與髓鞘的形成,髓鞘對于運動功能和行為能力有重要作用。本實驗顯示SAMP10脂筏磷脂組分及膽固醇含量均存在異常,提示因此而導(dǎo)致的神經(jīng)遞質(zhì)代謝障礙及信號傳導(dǎo)障礙可能是SAMP10腦組織老化及伴隨的智力低下的原因之一。膽固醇強化膜的剛性,而磷脂決定著膜的柔軟性[15]。由此我們推測,SAMP10脂筏較低的膽固醇濃度及PC、含不飽和脂肪酸鏈磷脂含量的增加可能導(dǎo)致脂筏流動性的改變,使其募集蛋白及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能都減弱,并影響其囊泡胞吐與胞吞、突觸傳遞及凋亡等生理與病理過程,從而影響SAMP10認知功能。

        針刺后SAMP10脂筏各種磷脂組分比例及含不飽和脂肪酸鏈的磷脂在各磷脂組分中所占的相對百分比都有不同程度的改變,脂筏膽固醇含量升高,趨向于正常對照組。結(jié)合針刺后水迷宮結(jié)果顯示SAMP10認知和記憶能力趨于正常小鼠,提示針刺可通過良性調(diào)節(jié)脂筏膽固醇的含量,維持SAMP10大腦皮層神經(jīng)元的脂筏結(jié)構(gòu)和功能,從而改善SAMP10認知障礙。脂筏在膜上并不是靜止不動的,當有刺激時它會運動、聚集,故針刺腧穴和非穴位刺激都能對其組分起到調(diào)節(jié)作用。針刺能良性調(diào)節(jié)脂筏膽固醇的含量,非穴刺激反而使脂筏膽固醇的含量降低,說明針刺和非穴對脂筏的調(diào)節(jié)作用明顯不同,這有可能是非穴組對認知的改善作用不明顯,而針刺組對認知有明顯改善作用的原因之所在。

        SAMP10脂筏磷脂中PI、PS、PC相對百分比升高,PG、PE相對百分比降低,針刺后PG、PE、PI、PS、PC相對百分比都不趨向于正常對照組,考慮兩種可能,針刺并不能良性調(diào)節(jié)脂筏磷脂中各組分的相對含量;或由于樣本量太少對結(jié)果造成影響。今后應(yīng)加大樣本量進行進一步研究。

        近年來國內(nèi)對脂質(zhì)代謝與AD關(guān)系的研究多集中在組織水平的血脂代謝上,從細胞水平探討脂類代謝與AD關(guān)系的并不多見,研究有很大的局限性。本研究從脂筏膽固醇含量及磷脂組成與AD的發(fā)病這一環(huán)節(jié)研究得出,調(diào)節(jié)脂筏膽固醇含量可能是“三焦”針法改善SAMP10鼠癡呆狀況的機制之一。我們的研究也存在一些不足之處,在我們的實驗中,鞘磷脂作為脂筏的重要組成成分沒有檢測;脂組學分析技術(shù)成本比較高,樣本例數(shù)過少;脂質(zhì)種類繁多,相互作用復(fù)雜,脂組學的分析可以涉及到很多方面,由于時間的關(guān)系,我們沒有從所有角度進行統(tǒng)計,因此只能對實驗結(jié)果做初步探討。所有這些,都為我們的下一步研究明確了方向。

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        CHEN Fu-yan1,2,NIE Kun1,YU Jian-chun1,HAN Jing-xian1.1.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine FirstHospital,Tianjin 300193,China;2.Tianjin University ofTraditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China

        R2-03

        A

        10.13460/j.issn.1005-0957.2016.02.0210

        1005-0957(2016)02-0210-04SAMP10 M ice

        國家自然科學基金項目(30873302,81072882)

        陳付艷(1981-),女,主治醫(yī)師,博士

        2015-05-20

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