張振國，郝爽，李繼，羅璋，馮守明，吳會民，姜巨峰，孫志景

（1.天津市水產(chǎn)研究所，天津300221；2.天津市寶坻區(qū)水產(chǎn)技術(shù)推廣站，天津301800）

?

魚用三聯(lián)口服疫苗的制備方法及其對大菱鲆的免疫效果

張振國1，郝爽1，李繼2，羅璋1，馮守明1，吳會民1，姜巨峰1，孫志景1

（1.天津市水產(chǎn)研究所，天津300221；2.天津市寶坻區(qū)水產(chǎn)技術(shù)推廣站，天津301800）

摘要：為探究海水養(yǎng)殖中安全可靠、經(jīng)濟適用的疫苗接種方法，以藥用淀粉、麥芽糊精，以及經(jīng)0.5%甲醛滅活的溶藻弧菌Vibrio alginolyticus、副溶血弧菌V.parahemolyticus和遲緩愛德華氏菌Edwardsiella tarda為主要原料，采用擠出-滾圓法制備魚用三聯(lián)口服疫苗，并用其對大菱鲆Scophthalmus maximus免疫，分別在免疫0、7、14、21、28 d時測定溶藻弧菌、副溶血性弧菌和遲緩愛德華氏菌特異性抗體，以1×109cfu/mL活菌 （3種菌液比例為1∶1∶1）進行攻毒試驗并計算免疫保護率。結(jié)果表明，藥用淀粉150 g、麥芽糊精50 g、菌液60 mL、擠出速度200 r/min、滾圓時間60 s時，為比較成熟的三聯(lián)口服疫苗制備工藝，用該疫苗免疫大菱鲆后，3種細菌的大菱鲆血清和后腸黏膜抗體效價均顯著高于對照組，且免疫保護率達50%以上。

關(guān)鍵詞：三聯(lián)口服疫苗；大菱鲆；免疫

目前，人工養(yǎng)殖海水魚細菌性疾病有逐年增加的趨勢，尤其是遲緩愛德華氏菌Edwardsiella tarda、溶藻弧菌 Vibrio alginolyticus和副溶血弧菌V.parahemolyticus的流行，使中國海水養(yǎng)殖業(yè)受到了嚴重影響。隨著高產(chǎn)、高效、集約化的新型養(yǎng)殖模式逐漸普及，細菌性疾病呈現(xiàn)出交叉感染、混合感染和多重感染的新特點，因此，一些學(xué)者進行了二聯(lián)疫苗、三聯(lián)疫苗和多聯(lián)疫苗的相關(guān)研究，如用溶藻弧菌和鰻弧菌二聯(lián)疫苗免疫大菱鲆Scophthalmus maximus［1］，用河弧菌和嗜水氣單胞菌二聯(lián)疫苗免疫鯽［2］，用嗜水氣單胞菌、副溶血弧菌和溶藻弧菌三聯(lián)疫苗免疫大黃魚［3］。齊彩霞等［4］研發(fā)了針對斑點叉尾鮰細菌性疾病的三聯(lián)疫苗。目前，疫苗的接種大多采用浸泡或注射方法，采用浸泡接種方式疫苗用量大、免疫效果不佳，采用注射接種方式則工作量大、過程繁瑣、傷口易感染。而口服接種疫苗操作方便、不損傷魚體、費用較低，適宜在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用，已成為魚用疫苗近年來的研究方向。為此，本研究中建立了溶藻弧菌、副溶血弧菌和遲緩愛德華氏菌三聯(lián)口服疫苗的制備方法，并對其免疫大菱鲆的效果進行了初步研究，旨在為探求海水養(yǎng)殖中安全可靠、經(jīng)濟適用的疫苗接種方法提供參考。

1　材料與方法

1.1材料

試驗用溶藻弧菌、副溶血弧菌和遲緩愛德華氏菌由天津市水產(chǎn)研究所水生生物防治研究室分離鑒定。試驗用大菱鲆幼魚購自天津盛億養(yǎng)殖有限公司，共20尾，體質(zhì)量為30～40 g，體長為15 cm。

主要儀器有HJ-400-P型微丸機 （重慶榮凱機械制造有限公司）。主要試劑包括藥用淀粉 （遼寧東源藥業(yè)有限公司）、麥芽糊精 （西王藥業(yè)有限公司）、二甲基-β-丙酸噻亭 （DMPT，東營百森有限公司）、丙烯酸樹脂 （EOBS60，天津愛勒易醫(yī)藥藥材有限公司）、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 （天津市英博生化試劑有限公司）。

1.2方法

1.2.1全菌滅活疫苗的制備 將3株菌接種于LB

1.2.2三聯(lián)口服疫苗的制備

（1）微丸。以藥用淀粉為載體、麥芽糊精為黏合劑，經(jīng)0.5%甲醛滅活的3株菌菌液按照一定比例制成微濕軟材，采用擠出-滾圓法制備微丸。

（2）腸溶層包衣。將腸溶型包衣材料丙烯酸樹脂溶于90%的乙醇中，制備成一定濃度的懸濁液，并使用包衣機均勻噴涂于疫苗微丸表面。

（3）誘食劑的噴涂。將二甲基-β-丙酸噻亭（DMPT）溶于水中，制成一定濃度的溶液，并使用包衣機均勻噴涂于腸溶層表面。

1.2.3三聯(lián)口服疫苗的安全性評價 取100 μL全菌滅活苗涂布于普通培養(yǎng)基上，35℃下培養(yǎng)48 h后，觀察有無菌落長出；取100 μL菌液 （1×109cfu/mL）注射到健康大菱鲆體內(nèi)，觀察記錄其1～7 d的死亡率。

1.2.4大菱鲆抗體效價和免疫保護率 水族箱小水體免疫大菱鲆試驗，設(shè)對照組和口服免疫組?？诜庖呓M每天投喂疫苗2次，連續(xù)投喂2 d，然后投喂正常飼料；對照組投喂正常飼料。試驗期間每7 d采血一次，從每組取4尾魚，采用ELISA法測定血清和后腸黏膜中的抗體平均水平。用含0.05%多聚賴氨酸的包被液在室溫下處理酶標(biāo)板1 h，再用低鹽洗液漂洗2次，加入100 μL抗原（1.0×108cfu/mL），4℃下過夜；加入 50 μL 0.05%戊二醛22℃下孵育20 min，用低鹽洗液漂洗3次；加入250 μL 1%牛血清白蛋白 （Sigma）22℃下封閉2 h，用低鹽洗液漂洗3次；加入100 μL樣品 （血清或后腸黏膜）4℃下過夜，用高鹽洗液漂洗5次，最后一次持續(xù)洗5 min；加入100 μL鼠抗大菱鲆Ig M單抗 （Aquatic Diagnostics Ltd）22℃下孵育1 h，漂洗過程同上一步；加入100 μL辣根過氧化物酶 （HRP）標(biāo)記的羊抗鼠 IgG （1/8000）22℃下孵育1 h，漂洗過程同上一步；加入100 μL TMB（四甲基聯(lián)苯胺）避光22℃下顯色5 min，加入50 μL終止反應(yīng)液；使用酶標(biāo)儀（ELX808）于波長450 nm處讀數(shù)；在加樣品的同時設(shè)PBS為陰性對照，當(dāng)S/P≥2時判為陽性 （S為樣品的OD值，P為陰性對照的OD值）。

免疫試驗進行28 d后，對試驗組和對照組進行3株細菌 （比例為1∶1∶1，菌液濃度為1×109cfu/mL）的人工感染，統(tǒng)計7 d內(nèi)魚的死亡率。免疫保護率 （RPS）計算公式為

2　結(jié)果與分析

2.1滅活疫苗的制備及安全性

遲緩愛德華氏菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌經(jīng)過0.5%福爾馬林滅活48 h，用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后無菌落生長，注射健康大菱鲆7 d內(nèi)無發(fā)病，說明已完全滅活。

2.2口服疫苗的制備工藝

根據(jù)趙偉等［6］的研究可知，影響微丸制備的因素主要有黏合劑糊精用量、水用量、滾圓機擠出速度、滾圓時間等。本研究中，根據(jù)前期試驗結(jié)果，選擇150 g藥用淀粉進行試驗，選擇以上4個因素，每個因素設(shè)置3個水平 （表1），按L9（34）正交試驗設(shè)計表安排試驗，結(jié)果見表2。

表1　因素和水平Tab.1 Factors and levels in preparation

以收率 （f）評價正交試驗的結(jié)果，即f= （12-20）目干燥丸芯的質(zhì)量 （g）/總投料量（g）×100%。由表2可見，4個因素的極差依次為RA＞RD＞RB＞RC，即影響疫苗收率的主要因素是麥芽糊精用量，工藝因素對收率影響較小，試驗結(jié)果與文獻［6-7］報道的一致。由極差分析結(jié)果得出最佳制備工藝理論組合為A2B3C3D2，考慮到C1與C3所對應(yīng)的收率差異不大，且正交試驗中A2B3C1D2組合 （6號試驗）的收率最高，由此確定，本試驗中最優(yōu)制備工藝條件為藥用淀粉150 g、麥芽糊精50 g、菌液60 mL、擠出速度200 r/min、滾圓時間60 s，在此工藝條件下，收率達78%。

2.3免疫效果評價

按照文獻［8］中的方法測定大菱鲆血清和后腸黏膜的抗體效價，結(jié)果見表3?？诜呙缃M大菱鲆血清和后腸黏膜中的遲緩愛德華氏菌、副溶血弧菌和溶藻弧菌的特異性抗體效價均在14 d時達到最大值，抗體效價顯著高于對照組 （P＜0.05）。

攻毒試驗結(jié)果顯示，口服疫苗組攻毒試驗7 d時死亡率遠低于對照組，免疫保護率達到50%（表4）。說明本試驗中制備的魚用三聯(lián)口服疫苗可以有效提高大菱鲆對3種細菌的抵抗力。

表2　正交試驗設(shè)計及試驗結(jié)果Tab.2 Design and results in an orthogonal test

3　討論

3.1三聯(lián)口服疫苗的制備工藝

本試驗中研制的三聯(lián)口服疫苗微丸，采用擠出-滾圓造粒法制備，該方法目前在制藥行業(yè)中應(yīng)用廣泛，但在水產(chǎn)疫苗研究方面尚未見報道。疫苗研制時，使用微丸機上不同的孔板擠壓制備成條狀，經(jīng)過轉(zhuǎn)盤轉(zhuǎn)動，依靠轉(zhuǎn)盤切割力、離心力和自身重力制成不同直徑的微丸，然后自然風(fēng)干、過分樣篩，得到成品疫苗。酸堿度、溫度、胃蛋白酶等是影響魚用口服疫苗免疫效果的主要因素，如不進行包膜直接口服，胃液會對疫苗抗原進行破壞，從而降低口服疫苗的效果。常見海水魚類如大菱鲆、牙鲆等，胃液pH一般為2.5～5.5，腸液pH為6.0～7.8。根據(jù)海水魚胃腸液pH值，可選用天津愛勒易藥材公司的腸溶型包膜劑，該包膜劑在pH 6.0以上時才能溶解，可有效保護口服疫苗在胃液中不被消化酶破壞，在后腸中釋放抗原，并通過與后腸黏膜充分接觸，發(fā)揮黏膜免疫作用。

表3　血清和后腸黏膜中3種細菌特異性抗體效價的平均值Tab.3 Average values of antibody for three bacteria in serum and hindgut

表4　攻毒試驗結(jié)果Tab.4 Result in an artificial infection test

3.2三聯(lián)口服疫苗的免疫效果

目前，魚類口服疫苗的研究主要集中在微膠囊疫苗方向。李新華等［9］采用6%PVP-K30和2%海藻酸鈉研發(fā)了針對銀鯽嗜水氣單胞菌病的口服微膠囊疫苗，免疫保護率為61.1%，高于全細胞疫苗組的50%；李梅芳等［10］制備了殼聚糖-海藻酸鈉包被的副溶血弧菌外膜蛋白K微球疫苗，對大黃魚免疫保護率為60%；丁詩華等［11］以聚乙烯醇和聚乳酸-乙醇酸共聚物（PLG）為原料，用復(fù)乳揮發(fā)法制備嗜水氣單胞菌口服疫苗，對魚的免疫保護率為42.9%，高于全細胞疫苗組的32.1%；張小江等［12］和任燕等［13］采用合成高分子聚DL-乳酸-聚乙二醇共聚物（PELA）包裹哈維氏弧菌Vibrio harveyi重組外膜蛋白微球制備口服疫苗；高銘蔚等［14］采用聚乳酸-羥基乙酸（PLGA）包裹無乳鏈球菌制備口服疫苗，對羅非魚免疫保護率為57.63%；孫翰昌等［15］以聚丙烯酸樹脂為材料，采用復(fù)乳溶劑揮發(fā)法制備腸型點狀產(chǎn)氣單胞菌疫苗微球。本試驗中制備的三聯(lián)口服疫苗采用投喂接種方式，與投喂普通餌料完全相同，省時省力，選用二甲基-β-丙酸噻亭為新一代誘食劑適合大多數(shù)海水魚口味，對大菱鲆免疫保護率達50%以上，可有效預(yù)防溶藻弧菌、副溶血弧菌和遲緩愛德華氏菌引發(fā)的相關(guān)疾病，在海水養(yǎng)殖中具有良好的應(yīng)用前景。

參考文獻：

［1］曹宏梅，李健，戰(zhàn)文斌.鰻弧菌和溶藻弧菌二聯(lián)疫苗對大菱鲆的免疫效果［J］.中國水產(chǎn)科學(xué)，2006，13（3）：397-402.

［2］李愛華，吳玉深，蔡桃珍，等.嗜水氣單胞菌和河弧菌二聯(lián)疫苗對鯽的免疫效果［J］.水生生物學(xué)報，2002，26（1）：52-56.

［3］吳志鵬，王三英.三聯(lián)疫苗對大黃魚常見細菌性疾病免疫保護的實驗研究［J］.廈門大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2004，43（1）：115-118.

［4］齊彩霞，張揚，裴家田，等.三聯(lián)疫苗預(yù)防斑點叉尾鮰細菌性疾病研究［J］.水利漁業(yè)，2005，25（5）：98-99.

［5］沈錦玉，許文軍，尹文林，等.哈維氏弧菌滅活疫苗在養(yǎng)殖大黃魚中的應(yīng)用與評價［J］.大連海洋大學(xué)學(xué)報，2010，25（3）：210-213.

［6］趙偉，潘家楨.擠出滾圓造粒法制備淀粉空白微丸芯核的工藝研究［J］.化工裝備技術(shù)，2005，26（2）：13-16.

［7］繆丹丹，朱家壁，卜小培.擠出滾圓法制備胃漂浮空白丸芯及其處方和工藝研究［J］.藥學(xué)進展，2007，31（3）：120-123.

［8］王秀華，周凌云，王玉娟，等.多效價載體疫苗免疫大菱鲆效果評價［J］.中國水產(chǎn)科學(xué)，2011，18（4）：918-923.

［9］李新華，沈錦玉，尹文林，等.銀鯽口服嗜水氣單胞菌疫苗的免疫和免疫組化研究［J］.水生生物學(xué)報，2007，31（1）：125-130.

［10］李梅芳，毛芝娟，韓雨杉，等.殼聚糖-海藻酸鈉包被的副溶血弧菌外膜蛋白K微球疫苗的制備及其口服免疫效果［J］.中國生物制品學(xué)雜志，2014，27（5）：301-306.

［11］丁詩華，王一丁，彭遠義，等.魚用嗜水氣單胞菌口服疫苗的免疫保護效應(yīng)［J］.西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2005，27 （6）：888-891，917.

［12］張小江，任燕，常藕琴，等.斜帶石斑魚口服PELA-OmpK微球疫苗的示蹤及免疫效果［J］.中國水產(chǎn)科學(xué)，2008，15（5）：837-844.

［13］任燕，張小江，常藕琴，等.PELA-OmpK微球疫苗的部分特征及其對鯽魚的口服免疫效果［J］.中國生物制品學(xué)雜志，2011，24（11）：1306-1309.

［14］高銘蔚，田園園，盧邁新，等.羅非魚無乳鏈球菌PLGA微球口服疫苗免疫效果的研究［J］.免疫學(xué)雜志，2015，31（2）：105-110.

［15］孫翰昌，楊帆.腸型點狀氣單胞菌口服疫苗微粒的制備及體外釋放研究［J］.水產(chǎn)科學(xué)，2008，27（12）：658-661.

中圖分類號：S942.5

文獻標(biāo)志碼：A

DOI：10.16535/j.cnki.dlhyxb.2016.03.004

文章編號：2095-1388（2016）03-0252-04

收稿日期：2015-08-27

基金項目：天津市科技計劃項目 （14ZXNZNC00046，15ZXBFNC00290）；天津市農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化與推廣項目 （201501030）；天津市水產(chǎn)局青年科技項目 （J2014-14青）

作者簡介：張振國 （1981—），男，工程師。E-mail：zhangzg8249@163.com

通信作者：馮守明 （1965—），男，博士，研究員。E-mail：smfeng65@163.com液體培養(yǎng)基中，副溶血弧菌和遲緩愛德華氏菌在35℃下培養(yǎng)24 h，溶藻弧菌在35℃下培養(yǎng)48 h，以5000 r/min離心并收集菌體，用福爾馬林滅活，參考沈錦玉等［5］的方法，以確定合適的福爾馬林濃度和滅活時間。

Preparation of triple oral vaccine for fish and primary immune effect on turbot Scophthalmus maximus

ZHANG Zhen-guo1，HAO Shuang1，LI Ji2，LUO Zhang1，F(xiàn)ENG Shou-ming1，WU Hui-min1，JIANG Ju-feng1，SUN Zhi-jing1
（1.Tianjin Fisheries Research Institute，Tianjin 300221，China；2.Baodi District Fisheries Technology Extension Station in Tianjin，Tianjin 301800，China）

Abstract：A triple oral vaccine for fish was prepared with medicinal starch，maltodextrin，and killed Vibrio parahemolyticus，Vibrio alginolyticus and Edwardsiella tarda by 0.5%formaldehyde，by extrusion and spheronization method，and turbot Scophthalmus maximus was immuned with the triple oral vaccine prepared.The indirect ELISA was used to measure the antibody titre of V.parahemolyticus，V.alginolyticus and E.tarda in serum and hindgut mucosa 0，7，14，21 and 28 days after vaccination.The relative percent survival（RPS）of the triple oral vaccine was calculated in the turbot challenged with live V.parahemolyticus，V.alginolyticus and E.tarda（1×109cfu/mL，with ratio of V.parahemolyticusto，and V.alginolyticus to E.tarda=1∶1∶1）.There was significantly higher antibody titer of the three bacteria in serum and hindgut mucosa，with RPS of more than 50%for the three bacteria above，in the triple oral vaccine prepared by 150 g of medicinal starch，50 g maltdextrin，60 mL of bacterial liquid，extrusion at 200 r/min，and spheronization in 60 s than that in the control group.

Key words：triple oral vaccine；Scophthalmus maximus；immune