戎鑫仁，賀婭莎，王　彥

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鹽酸小檗堿對糖尿病大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

戎鑫仁1，賀婭莎1，王彥2

1.山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院(太原 030001)；2.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院

摘要：目的觀察鹽酸小檗堿對高糖高脂膳食聯(lián)合鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病(DM)大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響，探討其治療糖尿病的可能機(jī)制。方法將雄性SD大鼠隨機(jī)分為3組：正常對照組(對照組，n=6)、高糖高脂膳食聯(lián)合鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)DM組(DM組，n=6)、高糖高脂膳食聯(lián)合鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)DM加小檗堿干預(yù)組(小檗堿組，n=6)。小檗堿干預(yù)12周后，微生物平板菌落計(jì)數(shù)法測定各組大鼠結(jié)腸內(nèi)糞便中大腸桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量，并測定大鼠體重、空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(FINS)及血漿內(nèi)毒素(LPS)水平，計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)。結(jié)果與對照組大鼠相比，DM組大鼠糞便中雙歧桿菌數(shù)量降低，大腸桿菌數(shù)量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；DM組大鼠體重、LPS、FBG、FINS、HOMA-IR升高(P<0.05)。與DM組大鼠相比，小檗堿組大鼠糞便中雙歧桿菌數(shù)量升高，大腸桿菌數(shù)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；小檗堿組大鼠體重、LPS、FBG、FINS、HOMA-IR降低(P<0.05)。結(jié)論鹽酸小檗堿可能通過改善腸道菌群結(jié)構(gòu)從而降低高糖高脂膳食聯(lián)合鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠的血漿內(nèi)毒素水平，改善其胰島素抵抗程度，發(fā)揮降糖作用。

關(guān)鍵詞：糖尿病；鹽酸小檗堿；腸道菌群結(jié)構(gòu)；空腹血糖；空腹胰島素；內(nèi)毒素

糖尿病(DM)與超重和肥胖，不合理的飲食結(jié)構(gòu)，以及現(xiàn)代生活方式等密切相關(guān)。最新資料顯示，我國成人糖尿病患病率為11.6%，而糖尿病前期人群已達(dá)50.1%[1]。目前研究證實(shí)，糖尿病是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，但其發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明。近年研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群可能在糖尿病的發(fā)病中發(fā)揮了重要的作用[2]。眾所周知，鹽酸小檗堿是治療腸道細(xì)菌感染疾病的藥物。研究提示，鹽酸小檗堿對以胰島素抵抗和慢性非特異性炎癥為特征的2型糖尿病也有治療作用[3]。本研究以高糖高脂膳食聯(lián)合鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病SD大鼠為研究對象，觀察鹽酸小檗堿對高糖高脂膳食誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響，并同步觀察大鼠體重、血糖、胰島素抵抗程度和血漿內(nèi)毒素水平，探討鹽酸小檗堿治療糖尿病的可能機(jī)制，為臨床治療策略提供新思路。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物健康雄性SPF級SD大鼠26只，鼠齡6周～8周，體重(180±20)g，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，清潔環(huán)境下飼養(yǎng)。普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分成兩組：正常對照組(對照組，n=6)、高糖高脂膳食聯(lián)合鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)DM模型組(DM模型組，n=20)，對照組給予普通飼料喂養(yǎng)，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。DM模型組先予以高糖高脂飼料喂養(yǎng)，飼料由70%基礎(chǔ)飼料+20%豬油+10%蔗糖+1%膽固醇+0.25%膽酸組成。兩組均天黑前投食，自由飲水，喂養(yǎng)12周后，隔夜禁食8 h后腹腔注射鏈脲佐菌素，劑量為30 mg/kg，于鼠尾處取血測定大鼠空腹血糖(FBG)，每2 d進(jìn)行一次，若FBG>7.8 mmol/L 則認(rèn)為造模成功，如連續(xù)2次以上FBG<7.8 mmol/L 則認(rèn)為造模失敗。將造模成功的12只DM大鼠再次隨機(jī)分成兩組，即高糖高脂飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素誘導(dǎo)DM組(DM組，n=6)，高糖高脂飲食聯(lián)合STZ誘導(dǎo)DM加小檗堿干預(yù)組(小檗堿組，n=6)。小檗堿組給予小檗堿150 mg /(kg·d)灌胃，以5%羧甲基纖維素鈉溶解小檗堿。對照組和DM組大鼠均給予等體積的5%羧甲基纖維素鈉灌胃。3組干預(yù)均持續(xù)12周。

1.1.2主要試劑與儀器蔗糖、膽固醇、膽酸：購自天津化工廠；深圳邁瑞GLU(葡萄糖氧化酶法)：購自深圳邁瑞公司；碘[125I]胰島素放射免疫分析藥盒：北京北方生物技術(shù)研究所；內(nèi)毒素(Endotoxin，ET)鱟試劑顯色基質(zhì)試劑盒：購自廈門鱟試劑公司；鹽酸小檗堿：購自北京中新制藥廠(使用時用5%羧甲基纖維素鈉溶解)；細(xì)菌培養(yǎng)基均購自青島海博生物技術(shù)有限公司；普通培養(yǎng)箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限醫(yī)療設(shè)備廠生產(chǎn)；厭氧培養(yǎng)箱：上海精密儀器有限公司；KDC-1044低速離心機(jī)：科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；GC-1200γ放射免疫計(jì)數(shù)器：科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；邁瑞B(yǎng)S-300全自動生化儀：深圳邁瑞公司；血糖儀及試紙：強(qiáng)生公司；EP管等耗材：購自山西賽奧生物科技有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1標(biāo)本采集于實(shí)驗(yàn)第24周末，將大鼠禁食8 h，測定大鼠體重，25%烏拉坦(4 mL/kg)麻醉大鼠，無菌環(huán)境下打開腹腔，經(jīng)腹主動脈采血，分離血漿2 mL分裝于無菌EP 管內(nèi)，同時將部分血漿3 000 r/min離心15 min分離血清，上述標(biāo)本凍存于-70 ℃冰箱。留取結(jié)腸內(nèi)足量糞便待統(tǒng)一檢測。

1.2.2血清指標(biāo)檢測上述血標(biāo)本同批測定以下指標(biāo)，鱟試劑顯色基質(zhì)法測血漿內(nèi)毒素(LPS)，葡萄糖氧化酶法測空腹血糖，放免法測空腹胰島素(FINS)，計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)，HOMA-IR=FINS×FBG/22.5。

1.2.3糞便中雙歧桿菌、大腸桿菌的檢測取1 g糞便置于10 mL的無菌試管，用無菌生理鹽水稀釋至10 mL并在振蕩器上混勻。將混勻液依次稀釋為10-2～10-8的系列濃度梯度，分別用微量吸管吸取各稀釋度的菌液50 μL(每個稀釋度做3個平行樣)涂布于相應(yīng)培養(yǎng)基上(大腸桿菌采用EMB培養(yǎng)基，雙歧桿菌采用BS培養(yǎng)基)。大腸桿菌在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，雙歧桿菌先經(jīng)厭氧系統(tǒng)處理后培養(yǎng)于37 ℃的恒溫厭氧環(huán)境。選取菌落數(shù)在30～300，且微生物細(xì)胞均勻分散的平板，以每克糞便中的菌落形成單位(cfu/g)進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果用其對數(shù)值表示。

2結(jié)果

2.1各組大鼠雙歧桿菌和大腸桿菌的變化鹽酸小檗堿干預(yù)12周后，與對照組相比，DM組大鼠雙歧桿菌數(shù)量降低，大腸桿菌數(shù)量增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與DM組相比，小檗堿組大鼠雙歧桿菌數(shù)量增高，大腸桿菌數(shù)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1。

表1　3組大鼠糞便中腸道菌群的數(shù)量(±s)　 cfu/g

2.2各組大鼠體重、空腹血糖、空腹胰島素和血漿內(nèi)毒素水平比較鹽酸小檗堿干預(yù)12周后，與對照組大鼠相比，DM組大鼠體重、LPS、FBG、FINS、HOMA-IR均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與DM組大鼠相比，小檗堿組大鼠體重、LPS、FBG、FINS、HOMA-IR均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。

表2　3組大鼠體重、FBG、FINS、LPS、HOMA-IR的比較(±s)

3討論

近年來，我國居民飲食結(jié)構(gòu)西化趨勢明顯，不僅增加了高飽和脂肪酸為主的肉類食物攝入量，同時也增加了蔗糖類食品的攝入。本研究選用高糖高脂膳食喂養(yǎng)的大鼠為研究對象，發(fā)現(xiàn)其腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，與對照組大鼠相比，高糖高脂膳食喂養(yǎng)的大鼠腸道內(nèi)雙歧桿菌的數(shù)量降低，而大腸桿菌的數(shù)量升高。近年研究發(fā)現(xiàn)：飲食結(jié)構(gòu)可影響哺乳類動物腸道內(nèi)各菌屬組成和數(shù)量，腸道菌群失衡與肥胖和糖尿病等相關(guān)代謝性疾病的發(fā)生有關(guān)[4-5]。研究證實(shí)：雙歧桿菌可改善腸黏膜的屏障功能，而大腸桿菌可產(chǎn)生多種有害的代謝產(chǎn)物[6-7]。Cani等[8]提出的“代謝性內(nèi)毒素血癥”學(xué)說認(rèn)為，各種致腸道菌群失調(diào)的因素使得腸道的通透性發(fā)生改變，腸道內(nèi)細(xì)菌及其組分或代謝產(chǎn)物中的脂多糖入血量增加，機(jī)體呈現(xiàn)出慢性低度炎癥狀態(tài)，引起以胰島素抵抗為特點(diǎn)的肥胖和糖尿病。本研究發(fā)現(xiàn)：與對照組大鼠相比，高糖高脂膳食喂養(yǎng)大鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，同時其體重、血漿LPS水平和HOMA-IR均顯著增高，這一結(jié)論為代謝性內(nèi)毒素血癥學(xué)說提供了證據(jù)。

近年研究發(fā)現(xiàn)小檗堿可用于2型糖尿病的治療，但機(jī)制尚未闡明。Lee等[9]研究提示：鹽酸小檗堿可能通過激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)和促進(jìn)肌管細(xì)胞GLUT4 的轉(zhuǎn)位發(fā)揮降糖作用。鑒于小檗堿在臨床上長期用于治療腸道感染性疾病，且不易經(jīng)腸道吸收入血，血藥濃度較低[10]，因此推測其可能通過調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)揮降糖作用。如果真是如此，小檗堿是否也可以改善血漿內(nèi)毒素水平，從而減輕胰島素抵抗程度。本研究發(fā)現(xiàn)：鹽酸小檗堿干預(yù)12周后，與DM組大鼠相比，小檗堿組大鼠雙歧桿菌數(shù)量顯著增高，大腸桿菌數(shù)量顯著降低；大鼠體重、血糖、LPS、HOMA-IR均顯著降低。提示鹽酸小檗堿可能通過改善腸道菌群結(jié)構(gòu)從而降低高糖高脂膳食誘導(dǎo)的糖尿病大鼠的血漿內(nèi)毒素水平，進(jìn)而改善其胰島素抵抗程度，發(fā)揮降糖作用。這一結(jié)論為鹽酸小檗堿用于治療糖尿病提供了新的思路和證據(jù)。然而本研究只檢測了腸道中具有代表性的兩種菌的變化，研究結(jié)果有一定的局限性。在進(jìn)一步的研究中可不僅限于動物研究，還可以擴(kuò)展到臨床研究，并應(yīng)用高通量測序技術(shù)等獲得更可靠的研究數(shù)據(jù)和結(jié)論。

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(本文編輯郭懷印)

通訊作者：王彥，E-mail：wyroad@126.com

中圖分類號：R587.1R255.4

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

doi：10.3969/j.issn.1672-1349.2016.11.012

文章編號：1672-1349(2016)11-1221-03

(收稿日期：2016-01-06)