高順利，王立忠，劉海英，劉丹莉

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miR-200a靶向調(diào)控AP-2γ表達(dá)抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK-N-AS細(xì)胞增殖

高順利，王立忠，劉海英，劉丹莉

摘要：目的明確miR-200a具有靶向調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子活化蛋白（AP）-2γ表達(dá)而抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖的能力，進(jìn)一步揭示miR-200a抗瘤的分子機(jī)制。方法通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因分析檢測(cè)miR-200a對(duì)AP-2γ 3′UTR-熒光素酶活性的影響；將miR-200a模擬物轉(zhuǎn)染神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，利用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和蛋白印跡（Western blot）方法檢測(cè)AP-2γ表達(dá)水平的改變；將AP-2γ shRNA轉(zhuǎn)染SK-N-AS細(xì)胞，MTS細(xì)胞增殖活性檢測(cè)分析干擾AP-2γ表達(dá)對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖能力的影響；將AP-2γ重組質(zhì)粒與miR-200a模擬物共轉(zhuǎn)染神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，通過(guò)MTS檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。結(jié)果miR-200a處理組細(xì)胞活性(66.33±5.13)與對(duì)照組的(100±0)相比，細(xì)胞增殖受到明顯抑制（F=114，P＜0.05）。與未轉(zhuǎn)入的相對(duì)熒光素酶活性（0.982±0.119）相比，miR-200a轉(zhuǎn)染明顯抑制AP-2γ的3′UTR驅(qū)動(dòng)的熒光素酶活性（0.624±0.051）。且miR-200a模擬物明顯降低神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中AP-2γ的mRNA和蛋白表達(dá)水平；此外，與對(duì)照組相比，shRNA干擾AP-2γ表達(dá)能明顯抑制SK-N-AS細(xì)胞的增殖(62.5±2.4)，它能部分模擬miR-200a的抑制增殖能力。最后，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)AP-2γ能部分逆轉(zhuǎn)miR-200a對(duì)SK-N-AS細(xì)胞的增殖抑制作用（92.4±1.4）。結(jié)論miR-200a通過(guò)靶向下調(diào)AP-2γ表達(dá)而抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖。

關(guān)鍵詞：神經(jīng)母細(xì)胞瘤；微RNAs；細(xì)胞增殖；AP-2γ；miR-200a

微小RNA(miR)-200家族包括miR-141、miR-429、miR-200a、miR-200b和miR-200c，5個(gè)成員，它們具有高度的同源性[1]。在人類(lèi)中miR-200a定位于1號(hào)染色體[2]，miR-200家族可以提高某些癌細(xì)胞的增殖能力[3]。小鼠乳腺腫瘤細(xì)胞中可以檢測(cè)到miR-200家族高表達(dá)，過(guò)表達(dá)miR-200a可使沒(méi)有侵襲能力的乳腺癌細(xì)胞獲得侵襲能力，然而miR-200a在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的功能和作用機(jī)制未知[4-5]。本研究采用生物信息學(xué)靶基因預(yù)測(cè)、逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和免疫印跡（Western blot）等分子生物學(xué)技術(shù)，旨在證實(shí)miR-200a通過(guò)直接靶向調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子活化蛋白（AP）-2γ的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)而抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖，從而揭示miR-200a在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的抗瘤功能和分子機(jī)制。

1　材料與方法

1.1主要材料RT-PCR試劑盒購(gòu)自大連寶生物工程公司。miR-200a模擬物及對(duì)照模擬物購(gòu)自Ambion公司。AP-2γ的shRNA購(gòu)自Santa Cruz公司。AP-2γ的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒、AP-2γ的3′UTR的各種報(bào)告基因（Mre vector，Wild-AP-2γ-3′UTR vector，Mut-AP-2γ-3′UTR vector）以及雙報(bào)告基因載體購(gòu)自復(fù)能基因公司。雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Promega公司。AP-2γ抗體和β-actin抗體購(gòu)自CST公司。Trizol和Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)life公司。RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清為Gibco公司產(chǎn)品。MTS細(xì)胞增殖/毒性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2MTS法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性分別將miR-200a的模擬物和對(duì)照模擬物轉(zhuǎn)染至神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK-N-AS細(xì)胞株，或者轉(zhuǎn)染miR-200a的模擬物后過(guò)表達(dá)AP-2γ的表達(dá)質(zhì)粒再轉(zhuǎn)染至神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK-N-AS細(xì)胞株，實(shí)驗(yàn)分為4組。不作任何轉(zhuǎn)染的為空對(duì)照組，轉(zhuǎn)染miR-200a模擬物和對(duì)照模擬物的分別為miR-200a處理組和對(duì)照組，而轉(zhuǎn)染miR-200a的模擬物后過(guò)表達(dá)AP-2γ的為過(guò)表達(dá)組。待細(xì)胞貼壁過(guò)夜后，消化細(xì)胞接種于96孔板中，每孔5 000個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，放37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)72 h后，每孔加20 μL MTS檢測(cè)試劑，37℃孵育2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定492 nm波長(zhǎng)的光密度值(OD492)。增殖活性=（處理組OD492/對(duì)照組OD492）×100%。

1.3熒光素酶活性檢測(cè)將各種熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒與miR-200a模擬物共轉(zhuǎn)染SK-N-AS細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后收獲細(xì)胞。按Promega公司雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)在檢測(cè)儀檢測(cè)細(xì)胞熒光素酶活性。其中，對(duì)照組轉(zhuǎn)染雙報(bào)告基因空白載體；Mre組為轉(zhuǎn)染單純的miR-200a反應(yīng)元件驅(qū)動(dòng)的熒光素酶報(bào)告載體；野生型組和突變型組分別為轉(zhuǎn)染AP-2γ的3′UTR和Mre缺失突變的AP-2γ的3′UTR-熒光素酶報(bào)告載體。熒光素酶活性比值=螢火蟲(chóng)熒光素酶活性值/海腎熒光素酶活性值。

1.4RT-PCR檢測(cè)以轉(zhuǎn)染對(duì)照模擬物為陰性對(duì)照（miRNC），不轉(zhuǎn)染任何載體的為空對(duì)照(Mock)，轉(zhuǎn)染miR-200a模擬物的為miR-200a處理組，而轉(zhuǎn)染AP-2γ-shRNA的為干擾組。細(xì)胞總RNA按Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)常規(guī)提取。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按大連寶生物工程公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，PCR按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，擴(kuò)增體系50μL。反應(yīng)條件：

95℃5min；95℃15 s；65℃20 s；72℃30 s；30個(gè)循環(huán)；72℃10 min。AP-2γ引物：上游5′-TGACCAAGAACCCTCT?GAACCT-3′；下游5′-CCAGGGACTGAGCAGAAGAC-3′，產(chǎn)物88 bp。GAPDH引物：上游5′-ACCCAGAAGACTGTG?GATGG-3′；下游5′-ACGCCTGCTTCACCACCTTC-3′，產(chǎn)物247 bp。

1.5Western blot實(shí)驗(yàn)分為以轉(zhuǎn)染對(duì)照模擬物為陰性對(duì)照（miR-NC），不轉(zhuǎn)染任何載體的為空對(duì)照(Mock)，轉(zhuǎn)染miR-200a模擬物組（miR-200a處理組），或AP-2γ shRNA轉(zhuǎn)染組（干擾組）和AP-2γ過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（過(guò)表達(dá)組），分別在48 h后提取細(xì)胞總蛋白或96 h后采用MTT法分析細(xì)胞增殖活性，并用BCA法測(cè)定蛋白濃度。各組取等量樣本，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5% BSA封閉，加入AP-2γ抗體或GAPDH抗體，4℃過(guò)夜。TBST洗膜30 min，加入二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜30 min，加入ECL發(fā)光劑，X線片曝光、顯影、定影。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用Graphpad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x ±s）表示。組間比較采用方差分析，多重比較采用LSD-t法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1miR-200a抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖3組間細(xì)胞增殖活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=114，P＜0.01），miR-200a處理組(66.33±5.13)與對(duì)照組的(100±0)相比，受到明顯抑制（P＜0.05），而空對(duì)照組的細(xì)胞增殖活性（101±2.00）與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果人類(lèi)AP-2γ的基因3′UTR上含有一個(gè)miR應(yīng)答元件，能夠與miR-200a相互作用，介導(dǎo)其轉(zhuǎn)錄調(diào)控，見(jiàn)圖1。轉(zhuǎn)染各種熒光素酶報(bào)告基因和miR-200a模擬物后，與對(duì)照組相比，野生型組和Mre組的熒光素酶活性比值顯著下降，而突變型組的熒光素酶活性比值沒(méi)有明顯變化，見(jiàn)表1。

Fig. 1 Schematics of the target genes of miR-200a and the luciferasereport constructs圖1　miR-200a作用的靶基因示意圖以及各種熒光素酶報(bào)告載體構(gòu)建示意圖

Tab. 1 miR-200a regulates luciferase activity driven by AP-2γ 3′UTR report constructs mediated by binding to the MRE element of promotor of AP-2γ表1　Mre元件介導(dǎo)了miR-200a對(duì)AP-2γ的3′UTR驅(qū)動(dòng)的熒光酶活性調(diào)控

2.3miR-200a下調(diào)AP-2γ的mRNA和蛋白表達(dá)水平轉(zhuǎn)染miR-200a組的AP-2γ mRNA和蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組明顯降低，并且其下調(diào)水平與AP-2γ干擾組的大致相當(dāng)，見(jiàn)圖2、3。

Fig. 2 AP-2γ mRNA expression detected by RT-PCR圖2　RT-PCR檢測(cè)AP-2γ的mRNA表達(dá)

Fig. 3 AP-2γ protein expression detected by Western blot assay圖3　Western blot檢測(cè)AP-2γ的蛋白表達(dá)

2.4下調(diào)AP-2γ表達(dá)可抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)染AP-2γ shRNA的SK-N-AS細(xì)胞AP-2γ蛋白的表達(dá)受到明顯抑制，見(jiàn)圖4。3組細(xì)胞增殖活性比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=282.0，P＜0.01），與對(duì)照組（100±0）相比，轉(zhuǎn)染AP-2γ shRNA的神經(jīng)母細(xì)胞增殖活性（62.5±2.4）受到明顯抑制（P＜0.05），而空對(duì)照組的（101.0±3.1）沒(méi)有明顯改變（P＞0.05）。

Fig. 4 Down-regulation of AP-2γ in neuroblastoma cells SK-N-AS by shRNA of AP-2γ transfection圖4　AP-2γ-shRNA轉(zhuǎn)染神經(jīng)母細(xì)胞SK-N-AS中下調(diào)AP-2γ的表達(dá)

2.5過(guò)表達(dá)AP-2γ逆轉(zhuǎn)miR-200a對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖抑制miR-200a明顯抑制AP-2γ的表達(dá)，而AP-2γ過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染拮抗miR-200a對(duì)AP-2γ的表達(dá)抑制，見(jiàn)圖5。相對(duì)于空對(duì)照組的細(xì)胞活性（100±0），miR-200a處理組細(xì)胞增殖活性為81.2± 1.2，下降了近19%，而AP-2γ過(guò)表達(dá)組的增殖活性為92.4±1.4，逆轉(zhuǎn)了miR-200a的抑制效應(yīng)（F= 236.5，P＜0.01）。

Fig. 5 Over-expression of AP-2γ reversed down-regulation effects of miR-200a to AP-2γ expression in SK-N-AS cells圖5　過(guò)表達(dá)AP-2γ逆轉(zhuǎn)miR-200a對(duì)AP-2γ的下調(diào)

3　討論

miR在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的作用越來(lái)越引起了人們的重視。許多報(bào)道揭示miR作為一類(lèi)新型基因調(diào)控分子，與神經(jīng)母細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[6]。本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-200a和（或）下調(diào)AP-2γ表達(dá)能抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖。而過(guò)表達(dá)AP-2γ能部分逆轉(zhuǎn)miR-200a對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖抑制作用。說(shuō)明miR-200a可通過(guò)靶向調(diào)控AP-2γ表達(dá)抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤增殖。同時(shí)也提示，除AP-2γ外，miR-200a還可能通過(guò)其他的靶基因來(lái)調(diào)控神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖。本研究揭示了miR-200a在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的抑瘤分子機(jī)制，與Yo?neyama等[7]的報(bào)道一致。也有研究報(bào)道m(xù)iR-200a可以通過(guò)直接靶向調(diào)控MACC1的轉(zhuǎn)錄進(jìn)而影響肝癌的生長(zhǎng)[8]。結(jié)合以上的結(jié)果可以認(rèn)為，miR-200a可以通過(guò)直接靶向不同的靶基因表達(dá)影響不同腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，那么miR-200a影響不同腫瘤的生長(zhǎng)具有細(xì)胞株的特異性，其特異性產(chǎn)生的分子機(jī)制不明了，關(guān)于這方面的研究缺乏報(bào)道，值得今后去探討。

AP-2蛋白是一類(lèi)非常重要的轉(zhuǎn)錄因子，其家族通過(guò)與其靶基因啟動(dòng)子上的作用元件結(jié)合而控制許多靶基因的特異性表達(dá),從而調(diào)控胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化、遷移和凋亡等多種生物過(guò)程[9-11]。AP-2γ與腫瘤基因的不穩(wěn)定性和腫瘤細(xì)胞的增殖、抗凋亡、侵襲、藥物抵抗密切相關(guān)，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[12]。本研究也發(fā)現(xiàn)敲低AP-2γ的表達(dá)可以明顯抑制骨肉瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移，這與文獻(xiàn)[13]的報(bào)道類(lèi)似。但是也有研究認(rèn)為AP-2γ的低表達(dá)可以促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移[11]。其具體的分子機(jī)制不清楚，筆者推測(cè)AP-2γ在不同腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮了促癌和抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，可能與其調(diào)控的靶基因有關(guān)，而在本研究中AP-2γ通過(guò)影響該靶基因的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移，有待下一步的研究去闡明。

本研究發(fā)現(xiàn)miR-200a靶向下調(diào)AP-2γ的表達(dá)，進(jìn)而抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，而過(guò)表達(dá)AP-2γ能部分逆轉(zhuǎn)miR-200a對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖抑制作用。提示miR-200a可部分通過(guò)靶向調(diào)控AP-2γ表達(dá)抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤增殖，在miR-200a影響神經(jīng)母細(xì)胞瘤生長(zhǎng)的分子機(jī)制中，可能通過(guò)多個(gè)途徑實(shí)現(xiàn)。

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（2015-07-28收稿2015-11-02修回）

（本文編輯魏杰）

實(shí)驗(yàn)研究

作者單位：湖南衡陽(yáng)，南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒科（郵編421001）

miR-200a inhibits cell proliferation by targeting AP-2γ expression in neuroblastoma cells SK-N-AS

GAO Shunli, WANG Lizhong, LIU Haiying, LIU Danli
Department of Pediatrics, the First Affiliated Hospital, University of South China, Hengyang, Hunan 421001, China

Abstract:Objective To investigate whether miR-200a suppresses cell proliferation by targeting AP-2γ expression, and reveal molecular mechanism that miR-200a functions as a tumor-suppressor in neuroblastoma cells. Methods Dualluciferase reporter gene assay was employed to examine the effect of miR-200a on AP-2γ promotor luciferase activity. Neu?roblastoma cells were transfected with miR-200a mimics, and the expressions of AP-2γ mRNA and protein were detected by RT-PCR and Western blot assay. The effects of AP-2γ down-regulation on cell proliferation were observed after AP-2γ shRNA was transfected into neuroblastoma cells. Neuroblastoma cell proliferation was detected by MTS assay after being cotransfected with miR-200a mimics and AP-2γ plasmid. Results Results showed that miR-200a could inhibit proliferation of neuroblastoma cells at cell viability (66.33±5.13) compared with that of control group (100±0), and also miR-200a can bind to the 3′untranslated region of AP -2γ promotor and inhibit its luciferase activity with an inhibit ratio at (0.624±0.051). AP-2γ mRNA and protein expressions were significantly down-regulated when miR-200a was over-expressed in neuroblas?toma cells. Furthermore, results showed that shRNA-mediated down-regulation of AP-2γ that suppressed the cell prolifera?tion of neuroblastoma at (62.5±2.4) by comparing with the control group (100±0). Moreover, restoring AP-2γ expression re?versed the effect of miR-200a with a cell viability suppression at (92.4±1.4). ConclusionmiR-200a suppresses cell prolif?eration by targeting AP-2γ expression in neuroblastoma cells.

Key words:neuroblastoma; microRNAs; cell proliferation; AP-2γ; miR-200a

中圖分類(lèi)號(hào)：R748

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI：10.11958/56744

基金項(xiàng)目：湖南省教育廳課題（13C802）

作者簡(jiǎn)介：高順利（1976），女，兒科副主任醫(yī)師，碩士研究生，主要從事兒科腫瘤及呼吸系統(tǒng)疾病方面研究