蘇慧慧，萬春友，魏蔚，孟海妹，焦亞沖，邢冬紅，鄭芳△

?

血清淀粉樣蛋白A誘導中性粒細胞胞外誘捕網形成

蘇慧慧1，萬春友2，魏蔚3，孟海妹1，焦亞沖1，邢冬紅1，鄭芳1△

摘要：目的探究血清淀粉樣蛋白A（SAA）能否在體外誘導中性粒細胞形成中性粒細胞胞外誘捕網（NETs）。方法建立穩(wěn)定的體外誘導NETs形成方法，包括外周血中性粒細胞的分離、細胞體外培養(yǎng)、NETs的誘導和形態(tài)學觀察。提取健康志愿者的外周血中性粒細胞，分為陰性對照（NC）組、SAA組和脂多糖（LPS）組，給予相應的刺激后，觀察NETs的形成并計算百分率，酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測培養(yǎng)上清中人組蛋白3（h3）的含量。結果提取的外周血中性粒細胞純度與細胞活力均在95%以上。顯微鏡下觀察到部分細胞的細胞核失去原有核型，向外擴散形成網狀，即NETs。與NC組相比，接受SAA刺激的中性粒細胞有更多的NETs形成（P < 0.05）。培養(yǎng)液上清中的h3含量顯著高于NC組（P < 0.05）。結論SAA可在體外誘導中性粒細胞形成NETs。

關鍵詞：血清淀粉樣蛋白A；中性粒細胞胞外誘捕網；中性粒細胞；炎癥；人組蛋白3

△通訊作者E-mail：zhengfang@tijmu.edu.cn

中性粒細胞胞外誘捕網（neutrophil extracellular traps，NETs）是中性粒細胞受到相應刺激時形成的以DNA為骨架，顆粒蛋白等黏附其上的網狀結構[1]。NETs形成后可限制感染的擴散，有免疫防御的功能[1]。此外，NETs還參與炎癥過程和一些自身免疫病的發(fā)生與發(fā)展[2]。血清淀粉樣蛋白A（serum amyloid A，SAA）是一種主要的急性時相反應蛋白，在一些炎癥性疾病中表達水平可大幅度升高。SAA作用于中性粒細胞，可趨化其向炎癥部位聚集，并誘導中性粒細胞表達多種細胞因子[3]。但SAA與中性粒細胞形成NETs這一過程的關系目前尚鮮見報道。本研究旨在探究SAA是否能夠誘發(fā)中性粒細胞形成NETs這一過程。

1　材料與方法

1.1材料Histopaque- 1119、Histopaque- 1077、脂多糖（LPS）均購于Sigma-Aldrich（德國）公司。重組人Apo-SAA購于peprotech（美國）公司。人組蛋白3（histone 3，h3）酶聯(lián)免疫試劑盒購于鑫樂（中國，上海）公司。無酚紅1640購于康寧公司。DAPI染料、紅細胞裂解液購于solarbio（中國）公司。

1.2方法

1.2.1中性粒細胞的分離選取4名2015年3—4月到天津醫(yī)科大學總醫(yī)院進行健康體檢的健康志愿者，清晨空腹采集靜脈血，EDTA抗凝，按如下步驟分離中性粒細胞。EDTA抗凝全血、Histopaque-1119、Histopaque-1077按2∶1∶1的比例加入離心管。首先加入3 mL Histopaque-1119，再將3 mL Histopaque-1077加于其上避免晃動，然后加入EDTA抗凝全血6 mL。700×g離心30 min低速制動。離心后His?topaque-1119及Histopaque-1077之間的細胞層為中性粒細胞。收集中性粒細胞，加入紅細胞裂解液1 mL，室溫裂解2 min，450×g離心3 min，加入PBS重懸，450×g離心3 min，如此洗2遍。加入無血清無酚紅的1640培養(yǎng)基重懸細胞，計數并將細胞稀釋至所需密度備用。4 g/L臺盼藍染色后觀察細胞活力。HE染色觀察（×400），隨機取10個視野并分類計數視野中全部細胞，計算中性粒細胞百分率。DAPI染色觀察細胞核形態(tài)。

1.2.2NETs的誘導提取中性粒細胞，血細胞計數板計數細胞個數。將細胞密度調至1.5×105個/孔，接種于鋪有蓋玻片的24孔板，置于含有5%CO2、37℃的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min。實驗分為3組：SAA組加入SAA，終濃度為25 mg/L（基于之前預實驗的結果）；陰性對照（NC）組加入等體積的Tris-HCL緩沖液作溶劑對照；LPS組加入LPS，終濃度為1 mg/L。每組樣本各設3個復孔。4 h后收集上清，350×g離心5 min，留取上清，存于-20℃?zhèn)溆谩？字屑尤?%多聚甲醛固定細胞爬片10 min，用于后續(xù)研究。

1.2.3NETs的觀察與評估細胞爬片固定后，0.01 mol/L PBS浸洗3次，每次5 min。之后0.05% trition通透1 min，0.5 mg/L DAPI染液避光染色5 min，0.01 mol/L PBS浸洗3次，甘油與水1∶1比例配置的封片液封片，熒光顯微鏡觀察。每個細胞爬片隨機計數10個視野中的NETs數和細胞總數，計算NETs形成百分率。

1.2.4細胞培養(yǎng)液上清中h3含量的檢測將樣本用稀釋液稀釋4倍后，按說明書上標明的程序，采用ELISA法檢測細胞培養(yǎng)液上清中h3含量。

1.3統(tǒng)計學方法采用SPSS 17.0軟件分析數據，作圖采用GraphPad Prism 5軟件，計量資料采用±s表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Dunnett-t檢驗，檢驗水準為雙側α=0.05。

2　結果

2.1中性粒細胞的提取鏡下可見中性粒細胞占所提取細胞總數的95%以上，見圖1 A。DAPI染色顯示細胞核為典型的分葉核，胞核邊界清晰可見，沒有模糊擴散等現(xiàn)象，見圖1 B。臺盼藍染色鑒定細胞活力顯示，細胞活力在98%以上，提示該提取方法切實可行。

2.2SAA體外誘導NETs形成

2.2.1各組NETs形成情況比較部分中性粒細胞細胞核失去原有的分葉形態(tài)，胞核邊界消失變得模糊，細胞核向外擴散，即形成NETs，見圖2。且SAA組與LPS組形成NETs的細胞數占總細胞數的百分率顯著高于NC組（P < 0.05）。提示SAA可促使中性粒細胞形成NETs，見圖3。

Fig. 1 Picture showing purified neutrophils圖1　提純的中性粒細胞

Fig. 2 Morphologic observation of neutrophils exposed to stimulants圖2　中性粒細胞被誘導后的形態(tài)學觀察（DAPI，×200）

Fig. 3 Comparison of percentages of NETs neutrophils between three groups圖3　各組形成NETs的細胞數占總細胞數的百分率比較

2.2.2各組細胞培養(yǎng)液上清中h3含量比較SAA組與LPS組細胞培養(yǎng)液上清中h3的含量高于NC組（P < 0.05）。說明SAA組比NC組有更多的細胞形成NETs，見圖4。

Fig. 4 Comparison of concentrations of h3 in supernatant between three groups圖4　各組細胞培養(yǎng)液上清中h3含量比較

3　討論

3.1NETs、SAA與炎癥自2004年NETs被首次報道[1]后，有關NET的研究取得了較快進展。研究顯示NETs除參與生理性的免疫防御外，還與多種炎癥相關疾病的病理過程密切相關。如系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）、類風濕關節(jié)炎（RA）、微小血管炎以及癌癥[2,4]等疾病中均有NETs的參與。SAA作為一種急性時相反應蛋白，在各種炎癥疾病中多有表達水平的升高，且發(fā)揮著復雜的免疫調節(jié)作用[5]。在一些感染性疾病和慢性炎癥性疾病如敗血癥[6-7]和類風濕關節(jié)炎[2,8]中，可見SAA表達量和NETs形成量同時升高。提示SAA與NETs的形成之間可能有一定程度的相關。

3.2培養(yǎng)液上清中h3的含量與NETs的形成h3是一種核蛋白，正常情況下存在于細胞核內。在NETs形成過程中，由于細胞膜及核膜的破裂，h3可進入培養(yǎng)液。因此培養(yǎng)液中的h3含量可以在很大程度上反映NETs的形成量。在分析ELISA與形態(tài)學計數的百分率結果時發(fā)現(xiàn)，二者的結果相一致，即不管是細胞培養(yǎng)液中h3的含量還是形成NETs細胞的百分率，SAA組與LPS組均顯著高于NC組。但是ELISA結果相較于百分率結果整體數值略高，可能由于實驗處理過程中不可避免有細胞損傷和胞膜破裂，致使h3的含量升高；另外NETs形成后隨時間推移可能會有擴散或分解。

3.3SAA與NETs的形成本研究顯示，SAA組與LPS組形成NETs細胞的百分率和細胞培養(yǎng)上清中h3的含量顯著高于NC組，提示SAA能夠誘導中性粒細胞形成NETs。之前的研究表明LPS能夠誘導中性粒細胞形成NETs[9]，這與本實驗結果相一致，說明本研究的實驗方法可靠。關于SAA與NETs形成之間的關系，目前尚鮮見相關報道。但是近來研究顯示SAA可誘導中性粒細胞產生活性氧簇（reac?tive oxygen species，ROS）[10]，而ROS的生成是NETs形成過程中的關鍵步驟。有研究指出，ROS可直接誘導中性粒細胞形成NETs[11]；在抑制與ROS生成相關的NADPH氧化酶和髓過氧化物酶后，NETs的形成受到抑制[11-12]。上述研究成果間接支持了本研究的結論，同時提示SAA或許經誘導ROS的產生，進一步誘發(fā)中性粒細胞形成NETs這一過程。

綜上，本研究結果提示SAA能夠在體外誘導中性粒細胞形成NETs。在體內環(huán)境中SAA也可能通過相似的機制影響免疫反應的進程。中性粒細胞形成NETs是一種新發(fā)現(xiàn)的重要的免疫過程。研究其與SAA之間的相互作用關系有助于進一步認識機體的免疫反應和相關疾病的病理機制。

參考文獻

[1] Brinkmann V, Reichard U, Goosmann C, et al. Neutrophil extracel?lulartraps kill bacteria[J]．Science, 2004, 303（5663）: 1532-1535. doi: 10.1126/science.1092385.

[2] Pinegin B, Vorobjeva N, Pinegin V, et al. Neutrophil extracellular traps and their role in the development of chronic inflammation and autoimmunity[J]. Autoimmun Rev, 2015, 14（7）: 633- 640. doi: 10.1016/j.autrev.2015.03.002.

[3] Migita K, Izumi Y, Jiuchi Y, et al. Serum amyloid A induces NLRP-3-mediated IL-1β secretion in neutrophils[J]. PLoS One, 2014, 9 （5）:e96703. doi: 10.1371/journal.pone.0096703.

[4] Cools-Lartigue J, Spicer J, Najmeh S, et al. Neutrophil extracellular traps in cancer progression[J]. Cell Mol Life Sci, 2014, 71（21）: 4179-4194. doi: 10.1007/s00018-014-1683-3.

[5] Ye RD, Sun L. Emerging functions of serum amyloid A in inflamma?tion[J]. J Leukoc Biol，2015, Jun 30. pii: jlb.3VMR0315-080R. doi: 10.1189/jlb.3VMR0315-080R. [Epub ahead of print]

[6] Pirillo A, Catapano AL, Norata GD. HDL in infectious diseases and sepsis[J]. Handb Exp Pharmacol, 2015, 224:483-508. doi: 10.1007/ 978-3-319-09665-0_15.

[7] Hashiba M, Huq A, Tomino A, et al. Neutrophil extracellular traps in patients with sepsis[J]. J Surg Res, 2015, 194（1）:248-254. doi: 10.1016/j.jss.2014.09.033.

[8] Shen C, Mu Y, Liu N, et al. The correlation between serum amyloid A and disease activity in patients with rheumatoid arthritis[J]. Tianjin Med J, 2014, 42（3）: 245-247. [沈忱,穆云,劉娜，等.血清淀粉樣蛋白A與類風濕關節(jié)炎疾病活動度的相關性研究[J].天津醫(yī)藥, 2014, 42（3）: 245-247]. doi:10.3969/j.issn.0253-9896.2014.03.016.

[9] Fuchs TA, Abed U, Goosmann C,et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps[J]. J Cell Biol, 2007, 176（2）: 231-241. doi: 10.1083/jcb.200606027.

[10] Bj?rkman L, Karlsson J, Karlsson A, et al. Serum amyloid A medi?ates human neutrophil production of reactive oxygen species through a receptor independent of formyl peptide receptor like-1[J]. J Leukoc Biol, 2008, 83:245-253. doi: 10.1189/jlb.0607-408.

[11] Nishinaka Y, Arai T, Adachi S, et al. Singlet oxygen is essential for neutrophil extraeellular trap formation[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2011, 413（1）: 65-79. doi: 10.1016/j.bbrc.2011.08.052.

[12] Parker H, Winterbourn CC. Reactive oxidants and myeloper oxidase and their involvement in neutrophil extracellular traps[J] . Front Im?munol, 2013, 3: 424. doi: 10.3389/fimmu.2012.00424.

（2015-10-19收稿2015-11-01修回）

（本文編輯李鵬）

作者單位：1天津醫(yī)科大學醫(yī)學檢驗學院免疫學教研室（郵編300203）；2天津市天津醫(yī)院；3天津醫(yī)科大學總醫(yī)院

Serum amyloid A induces the formation of NETs

SU Huihui1, WAN Chunyou2, WEI Wei3, MENG Haimei1, JIAO Yachong1, XING Donghong, ZHENG Fang1△
1 Department of Immunology, School of Laboratory Medicine, Tianjin Medical University, Tianjin 300203, China; 2 Tianjin Hospital; 3 General Hospital of Tianjin Medical University
△Corresponding Author E-mail: zhengfang@tijmu.edu.cn

Abstract：Objective To explore whether serum amyloid A (SAA) can induce the formation of neutrophil extracellular traps（NETs）in neutrophils in vitro. Methods A stable method for inducing NETs formation in vitro was established, in?cluding isolation of peripheral blood neutrophils, cell culture, and NETs formation and observation. The neutrophils were iso?lated from peripheral blood of healthy volunteers. And cells were cultured in vitro and classified into three groups: negative control (NC) group, SAA group and lipopolysaccharide (LPS) group. Following the distinct stimulation in three groups, NETs formation was observed and its percentage was calculated. The concentration of hinstone (h) 3 in supernatant was detected by ELISA. Results The purification and vitality of isolated neutrophils were both more than 95%. The nuclei of neutrophils lost their shape and spread, NETs formation was found. More NETs formation was found in SAA group than that in NC group (P < 0.05). Moreover, the concentration of h3 in supernatant was significantly higher in SAA group than that in NC group (P < 0.05). Conclusion SAA can induce the formation of NETs in vitro.

Key words：serum amyloid A protein；neutrophil extracellular traps; neutrophil；inflammation；hinstone 3

中圖分類號：R392.11

文獻標志碼：A

DOI:10.11958/20150240

基金項目：天津市應用基礎與前沿技術研究計劃項目（14JCYBJC25600）

作者簡介：蘇慧慧（1990），女，碩士在讀，主要從事中性粒細胞胞外誘捕網與類風濕關節(jié)炎相關研究