周迎輝　胡方平　蔡學(xué)清

摘 要 從本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的西瓜細(xì)菌性果斑病菌菌株A13的Mini-Tn5轉(zhuǎn)座子突變體庫中篩選出2株致病性喪失的突變菌株166和167，亞克隆及測序結(jié)果表明，突變株166和167 的Tn5插入位點(diǎn)基因編號分別為Aave-3192和Aave-2108。為了進(jìn)一步明確這2個基因的功能，分別對這2個基因進(jìn)行互補(bǔ)。生物學(xué)試驗(yàn)結(jié)果表明，互補(bǔ)菌株恢復(fù)對西瓜果實(shí)的致病性，且在游動性、群體感應(yīng)、胞外多糖、生物膜等性狀上部分恢復(fù)至野生菌株A13的水平，表明這2個基因與該病菌在西瓜上的致病性相關(guān)。

關(guān)鍵詞 西瓜細(xì)菌性果斑病菌；基因突變；基因互補(bǔ)；生物學(xué)測定

中圖分類號 S432.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract Two mutants（166 and 167） lacked of pathogenicity from the mutant library of wild strain A13 （Acidovorax citrulli）of bacterial fruit blotch of watermelon constructed by insertion of transposon Mini-Tn5was screened. The Tn5 inserted genes of mutant166 and mutant167 were Aave-3192 and Aave-2108 respectively by subcloning and sequence blasting. To identify the functions of the two genes， the complementary strains 166hb and 167hb were constructed， and the pathogenicity and some other biological characters were tested. The results showed that the characters of the two strains were recovered on pathogenicity， motility， quorum sensing， exo-polysaccharides， the colonial morphology and biofilm inordinately. Overall， the results indicated that the two genes were related to the pathogenicity of BFB on watermelon.

Key words Acidovorax citrulli；Gene mutation；Gene complement；Biological determination

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.07.014

西瓜細(xì)菌性果斑病（Bacteria Fruit Blotch of Watermelon）是西瓜上重要的病害之一，由西瓜噬酸菌（Acidovorax citrulli， Ac）[1]侵染引起。作為世界性檢疫病害，由于缺少有效的管控措施，近年來已經(jīng)給多個國家的瓜類產(chǎn)業(yè)帶來巨大的損失。該病菌的致病機(jī)制研究結(jié)果表明，Ⅱ型[2]、Ⅲ型[3-6]、Ⅳ型[7-10]、Ⅵ型[11]分泌系統(tǒng)均參與了該病菌的致病，如Johnson等[2]報(bào)道了Ⅱ型分泌系統(tǒng)有助于西瓜噬酸菌在西瓜種子到苗期的傳播和定殖，還證實(shí)Ⅲ型分泌系統(tǒng)基因hrcC（編碼Ⅲ型菌毛蛋白）是重要的致病因子。本研究小組構(gòu)建了野生菌A13的Tn5插入突變體文庫，通過篩選獲得2株致病性喪失的突變菌株166和167，在此基礎(chǔ)上，通過亞克隆技術(shù)確定Tn5插入基因?yàn)锳ave-3192（Hypothetical protein）和Aave-2108（Methyl-accepting chemotaxis sensory transducer）。已有研究報(bào)道偽茄拉爾氏菌（Ralstonia pseudosolanacearum）強(qiáng)致病性菌株MAFF106611的甲基受體趨化性蛋白基因mcpM的突變體較野生菌株的侵染能力顯著降低[12]，而在果斑病菌中尚未見這2個基因功能的相關(guān)研究報(bào)道，本研究擬通過基因互補(bǔ)的方法，進(jìn)一步探討其功能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株和質(zhì)粒 西瓜細(xì)菌性果斑病菌株A13（RifR）、突變株166和突變株167（RifR，KmR）、大腸桿菌DH5α、質(zhì)粒pBluescriptⅡks（+）（AmpR）、pBBR1MCS-5（GmR）為本實(shí)驗(yàn)室保存，助手菌DH5α（pRK 600）（CmR）、 Agrobacterium tumefaciensNTL4由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)張力群教授惠贈，Erwinia carotovora subsp.carotovora（Ecc-1）由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院趙廷昌研究員惠贈，pMD19-T購自TaKaRa。

1.1.2 供試西瓜和甜瓜品種 西瓜種子（特大西紅寶）購于市場，甜瓜種子由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院趙廷昌研究員惠贈。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB、KB培養(yǎng)基配制參照方中達(dá)《植病研究法》第三版[13]，ABM培養(yǎng)基參照劉鵬等[14]的方法。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)使用的抗生素及工作濃度 利福平Rif 100 μg/mL，氨芐青霉素Amp 50 μg/mL，卡那霉素Km 50 μg/mL，氯霉素Cm 20 μg/mL，慶大霉素Gm 25 μg/mL。

1.1.5 試劑 質(zhì)粒小量提取試劑盒、核酸染料Gelstain、高保真酶HiFi Taq、2×EasytaqPCRMix和基因組DNA提取試劑盒購自全式金生物技術(shù)有限公司，DNA純化試劑盒購自TIANGEN，限制性內(nèi)切酶PstⅠ、 KpnⅠ、 XbaⅠ、 T4 ligase等購自TaKaRa。

1.1.6 引物 本研究使用的引物見表1。

1.2 方法

1.2.1 菌株的培養(yǎng) 將野生菌株A13、突變菌株和互補(bǔ)菌株轉(zhuǎn)到KB平板上，于28 ℃恒溫培養(yǎng)24～48 h或接種到KB液體培養(yǎng)基（28 ℃，180 r/min）培養(yǎng)，備用。其中突變菌株和互補(bǔ)菌株在培養(yǎng)基中添加相對應(yīng)的抗生素。

1.2.2 亞克隆定位突變株中Tn5的插入位點(diǎn) 分別提取突變株166和167的基因組DNA及pBluescriptⅡks（+）質(zhì)粒DNA（參照提取試劑盒說明書），用限制性內(nèi)切酶PstⅠ分別酶切突變株166和167的基因組DNA和pBluescriptⅡks（+）的質(zhì)粒DNA（37℃，3～4 h），并對酶切質(zhì)粒pBluescriptⅡks（+）去磷酸化處理（37 ℃，1 h）?；厥彰盖挟a(chǎn)物，將基因組酶切產(chǎn)物和質(zhì)粒DNA的酶切產(chǎn)物通過T4 ligase連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，具體步驟參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》[16]，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布含有50 μg/mL Amp、50 μg/mL Km的LB抗性平板進(jìn)行篩選，37 ℃倒置培養(yǎng)約16 h，挑取克隆子，提取質(zhì)粒DNA，通過PstⅠ酶切驗(yàn)證。將驗(yàn)證正確的克隆子菌液送上海生物工程有限公司測序，獲得Tn5側(cè)翼序列，測序結(jié)果在NCBI上與西瓜噬酸菌基因組AAC00-1序列（GenBank登錄號NC-008752）比對，確定Tn5轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)。

1.2.3 互補(bǔ)菌株構(gòu)建及驗(yàn)證 互補(bǔ)載體的構(gòu)建：根據(jù)西瓜噬酸菌AAC00-1基因組中Aave-3192和Aave-2108基因的序列，設(shè)計(jì)2對引物166F/R和167F/R，以A13基因組為模板分別擴(kuò)增相應(yīng)的基因片段，將擴(kuò)增得到的基因片段回收純化，對純化產(chǎn)物和pBBR1MCS-5質(zhì)粒DNA分別進(jìn)行雙酶切（KpnⅠ和XbaⅠ），再回收純化，16 ℃連接，轉(zhuǎn)化，涂布含有Gm抗性的LB平板，培養(yǎng)約16 h，挑取陽性克隆子進(jìn)行PCR驗(yàn)證（引物分別為166F/R、167F/R）和KpnⅠ/XbaⅠ酶切驗(yàn)證，測序結(jié)果與西瓜噬酸菌基因組AAC00-1序列比對一致后即獲得互補(bǔ)載體pBBR1MCS-5-166和pBBR1MCS-5-167。

互補(bǔ)菌株的獲得：參照Kessler等[17]的方法，分別在含有相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基中接種受體菌166和167，28 ℃培養(yǎng)24 h；助手菌DH5α（pRK 600）和供體菌DH5α（分別含互補(bǔ)載體pBBR1MCS-5-166和pBBR1MCS-5-167），37 ℃培養(yǎng)16 h；吸取300 μL，12 000 r/min分別離心，去凈上清，加入300 μL的無菌水重懸浮，12 000 r/min分別離心，去凈上清，再加入300 μL的無菌水重懸浮，將三親本混合均勻，12 000 r/min離心，去凈上清，加入100 μL的無菌水重懸浮，將懸浮液點(diǎn)接于KB平板上，28 ℃培養(yǎng)6～8 h，用無菌水洗下菌苔，將原液和10-1稀釋液涂布至含有Rif、Gm和Km的抗性平板上，28 ℃培養(yǎng)4～5 d，挑取克隆子進(jìn)行西瓜果斑病菌特異性引物SEQID4m/5和互補(bǔ)基因引物166F/R、167F/R的PCR驗(yàn)證。

1.2.4 生物學(xué)測定 （1）煙草過敏反應(yīng)：將待測定的野生菌株、突變株及互補(bǔ)菌株菌液調(diào)至OD600=0.6，以清水作陰性對照，用醫(yī)用無菌注射器接種到煙草葉片內(nèi)，每個處理重復(fù)3次，12～24 h觀察記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

（2）致病性測定：果實(shí)針刺接種參照蔡學(xué)清等[18]的方法；甜瓜種子接種參照李明明等[19]的方法，稍作改進(jìn)，將帶菌種子散播在滅菌的0.8%的水瓊脂中，于28 ℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周，觀察記錄發(fā)病情況。

（3）游動性測定：參照Chesnokova等[20]的方法，取2 μL OD600=1.5的菌液點(diǎn)接于0.3%的半固體KB培養(yǎng)基上，于28 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)2 d或以上，比較觀察細(xì)菌的運(yùn)動痕跡。

（4）群體感應(yīng)：參照孫蕾[21]的實(shí)驗(yàn)方法，28 ℃避光培養(yǎng)24 h后，觀察記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

（5）培養(yǎng)基上的生長情況測定：將A13、突變株、互補(bǔ)菌株分別在NA平板上劃線，28 ℃培養(yǎng)72 h后，觀察NA平板上菌落形態(tài)[22]。

（6）生物膜測定：參照嚴(yán)婉榮等[23]的方法測定生物膜形成能力，并用無水乙醇將結(jié)晶紫染色的生物膜洗脫下來，測量OD540的值[24]。

（7）胞外多糖：參照He等[25]的方法，從25 mL菌液中收集產(chǎn)生的胞外多糖，置于37 ℃烘干2 d后稱重。

（8）生長曲線：將A13、突變株和互補(bǔ)菌株在KB上活化后，參照嚴(yán)婉榮[23]的方法進(jìn)行生長曲線的測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞克隆測序分析轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)

亞克隆子質(zhì)粒酶切驗(yàn)證結(jié)果見圖1和圖2，電泳結(jié)果顯示共2條條帶，一條為質(zhì)粒pBluescriptⅡks（+）片段（約3 000 bp），另一條為Tn5（約1 500 bp）插入突變的DNA片段（約2 000～2 500 bp）。測序結(jié)果通過NCBI的Blast比對分析，結(jié)果表明，這2個突變株的Tn5轉(zhuǎn)座子的插入位置分別位于3 523 353～3 523 372和2 314 449～2 314 456，插入基因分別為Aave-3192和Aave-2108，其中Aave-3192基因NCBI上的注釋為Hypothetical protein，Aave-2108基因在NCBI上的注釋為Methyl-accepting chemotaxis sensory transducer。

2.2 互補(bǔ)菌株的構(gòu)建

互補(bǔ)載體pBBR1MCS-5-166和pBBR1MCS-5-167克隆子PCR驗(yàn)證（圖3-A）分別能夠擴(kuò)增得到與目的基因條帶大小一致的片段，分別約為561、1 796 bp；且質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證結(jié)果均可獲得一條質(zhì)粒大條帶和一條與目的基因片段大小一致的小條帶（圖3-B，泳道3和4），即獲得互補(bǔ)載體pBBR1MCS-5-166和pBBR1MCS-5-167。

三親雜交轉(zhuǎn)化克隆子互補(bǔ)基因的PCR驗(yàn)證，結(jié)果表明所獲得的克隆子均可擴(kuò)增到相應(yīng)的條帶，大小分別為561、1 796 bp（圖4）。果斑病菌特異性PCR驗(yàn)證，均得到大小約250 bp的條帶（圖5），即獲得互補(bǔ)菌株166hb和167hb。

2.3 生物學(xué)測定

2.3.1 煙草過敏反應(yīng) 突變菌株166和167在煙草上不能引起過敏反應(yīng)，互補(bǔ)菌株166hb、167hb和野生菌株A13均能產(chǎn)生煙草過敏反應(yīng)。

2.3.2 致病性測定 由圖6可知，野生菌株和互補(bǔ)菌株均能使西瓜果實(shí)致病，突變株無致病性，表明基因互補(bǔ)后菌株的致病性恢復(fù)。但甜瓜浸種結(jié)果表明互補(bǔ)菌株和突變菌株均無致病性（圖7）。

2.3.3 游動性 突變菌株在0.3%的KB培養(yǎng)基上的菌落直徑較野生菌株小，而互補(bǔ)后的菌株（166hb和167hb）的菌落直徑增大，但均略小于野生菌株A13。

2.3.4 在NA平板上菌落的生長情況 從圖8可看出，野生菌A13菌落邊緣形成薄而透明的菌裙，突變株166和167菌落無此形態(tài)特征，互補(bǔ)菌株166hb和167hb菌落邊緣也形成薄而透明的菌裙，但比野生菌株窄。

2.3.5 生物膜 從圖9可看出，突變株166和167的生物膜形成能力均強(qiáng)于A13，互補(bǔ)菌株166hb和167hb的生物膜形成能力較突變株下降，其中互補(bǔ)菌株166hb的生物膜形成能力接近于野生菌株。

2.3.6 群體感應(yīng) 互補(bǔ)菌株166hb和167hb群體感應(yīng)信號強(qiáng)度較突變體下降，166hb菌株與A13信號強(qiáng)度基本一致。

2.3.7 胞外多糖 由圖10可知，每25 mL菌液中A13的胞外多糖產(chǎn)量為0.011 5 g，166為0.007 8 g，167為0.007 9 g，166hb為0.009 2 g，167hb為0.009 0 g?；パa(bǔ)菌株的胞外多糖產(chǎn)量均較突變株高，但低于野生菌株。

2.3.8 生長曲線 由圖11和圖12可看出，突變菌株和互補(bǔ)菌株的生長趨勢與野生菌株一致，但生長速度均較野生菌株慢，而突變菌株和互補(bǔ)菌株的生長速度一致。

3 討論與結(jié)論

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，突變株166和167喪失對西瓜、甜瓜的致病性，不能激發(fā)煙草過敏反應(yīng)，通過亞克隆技術(shù)確定插入基因?yàn)锳ave-3192和Aave-2108，分別編碼Hypothetical protein和Methyl-accepting chemotaxis sensory transducer。通過基因互補(bǔ)，獲得了突變株的互補(bǔ)菌株166hb和167hb。生物學(xué)測定結(jié)果表明，互補(bǔ)菌株恢復(fù)對西瓜的致病性煙草過敏性反應(yīng)，表明這2個基因與該病菌的致病性相關(guān)；另外，兩互補(bǔ)菌株的游動性、生物膜形成能力、群體感應(yīng)、胞外多糖也部分恢復(fù)，說明這2個基因與該病菌的游動性、生物膜、群體感應(yīng)等生物學(xué)有關(guān)?，F(xiàn)已報(bào)道瓜類細(xì)菌性果斑病菌存在種內(nèi)遺傳多樣性，分屬亞群Ⅰ和亞群Ⅱ，亞群Ⅰ的菌株主要分離自甜瓜、南瓜等，亞群Ⅱ的菌株主要分離自西瓜，且亞群Ⅱ的菌株對西瓜幼苗的侵染力明顯強(qiáng)于亞群Ⅰ，對甜瓜、南瓜的侵染力弱于亞群Ⅰ[26]。而本研究結(jié)果表明，野生菌株對西瓜、甜瓜均有致病性，當(dāng)基因Aave-3192和Aave-2108的插入突變后使其喪失對西瓜、甜瓜的致病性；但互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，恢復(fù)對西瓜的致病性，而不能恢復(fù)對甜瓜的致病性。通過PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在亞群Ⅰ和亞群Ⅱ菌株中均可擴(kuò)增到基因Aave-3192，但基因Aave-2108只能在亞群Ⅱ菌株中擴(kuò)增到而未在亞群Ⅰ菌株中擴(kuò)增到（實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)），由此可推測果斑病菌的這2個基因可能與該病菌的寄主的選擇性有關(guān)，這有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。

NCBI中基因Aave-3192注釋的編碼產(chǎn)物為Hypothetical protein，目前尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)該基因功能的研究報(bào)道，本研究結(jié)果表明該基因與西瓜噬酸菌的致病性相關(guān)，而關(guān)于該基因所編碼的蛋白性質(zhì)及其功能有待于進(jìn)一步研究；而NCBI中基因Aave-2108編碼產(chǎn)物為甲基受體趨化感應(yīng)傳感（Methyl-accepting chemotaxis sensory transducer），現(xiàn)已研究表明，銅綠假單胞菌的類甲基受體趨化化學(xué)傳感器蛋白pilJ直接與菌毛蛋白亞基pilA作用，改變伸展?fàn)顟B(tài)下的Ⅳ型菌毛的構(gòu)象，從而改變銅綠假單胞菌的顫動性、調(diào)控表面誘導(dǎo)基因的表達(dá)和致病性[27]。本研究結(jié)果表明，突變株167是由于Tn5插入果斑病菌的Aave-2108基因（編碼產(chǎn)物為甲基受體趨化感應(yīng)傳感器）而導(dǎo)致其喪失對西瓜、甜瓜的致病性，但其具體是通過什么途徑使其喪失致病性，是否與上述報(bào)道一致等均有待于進(jìn)一步研究。

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