夏彥飛　喬俊卿　張雪雯　楊列祥

摘要：采用形態(tài)鑒定法、同工酶法、PCR法對(duì)山東省棗莊市榴園鎮(zhèn)石榴園一株枯死石榴樹(shù)的根結(jié)線蟲(chóng)樣本進(jìn)行了鑒定，病原線蟲(chóng)鑒定為南方根結(jié)線蟲(chóng)。

關(guān)鍵詞：石榴；根結(jié)線蟲(chóng)；鑒定

根結(jié)線蟲(chóng)是植物寄生線蟲(chóng)中危害重、寄主廣泛的一類線蟲(chóng)，目前為止，已經(jīng)近百種。根結(jié)線蟲(chóng)通過(guò)2齡幼蟲(chóng)侵入寄主根系維管束后固定取食并發(fā)育為成蟲(chóng)，線蟲(chóng)在發(fā)育過(guò)程中干擾寄主植物的正常生理過(guò)程，導(dǎo)致寄主植物呈現(xiàn)特異性的根結(jié)病害癥狀。石榴樹(shù)是一種原產(chǎn)自西域的果樹(shù)，經(jīng)絲綢之路傳至中原，因其樹(shù)姿優(yōu)美，花期長(zhǎng)，且果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富，是具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的樹(shù)種之一。山東省棗莊市是中國(guó)重要的石榴產(chǎn)區(qū)之一，隨著石榴樹(shù)齡的增長(zhǎng)、樹(shù)勢(shì)的衰弱及病蟲(chóng)的侵害，常常導(dǎo)致嚴(yán)重減產(chǎn)甚至樹(shù)木死亡，這一問(wèn)題已成為棗莊石榴產(chǎn)業(yè)發(fā)展和農(nóng)民增收的重要障礙。根結(jié)線蟲(chóng)病是石榴樹(shù)常見(jiàn)病害之一，由于其破壞根系影響?zhàn)B分的疏導(dǎo)，特別是對(duì)樹(shù)齡較高的石榴樹(shù)危害更大。已報(bào)道危害石榴樹(shù)的根結(jié)線蟲(chóng)有多個(gè)種，山東棗莊地區(qū)根結(jié)線蟲(chóng)種類尚不明確。本研究通過(guò)會(huì)陰花紋特征，采用形態(tài)鑒定法、SCAR-PCR法、同工酶法對(duì)山東省棗莊市榴園鎮(zhèn)石榴園一株枯萎石榴樹(shù)的根結(jié)線蟲(chóng)樣本進(jìn)行種類鑒定。

1.材料與方法

1.1雌蟲(chóng)會(huì)陰花紋的形態(tài)觀察

用挑針挑取棗莊市榴園鎮(zhèn)石榴園枯萎石榴植株根結(jié)中的雌性成蟲(chóng)，放在含有45%乳酸溶解液的載玻片上，在解剖鏡下用解剖刀切取蟲(chóng)體的會(huì)陰部角質(zhì)膜，輕輕剔除內(nèi)含物，清洗干凈后，將角質(zhì)膜置于甘油中制成永久玻片，顯微鏡下觀察會(huì)陰花紋特征。

1.2SCAR-PCR分析

SCAR-PCR擴(kuò)增所用的特異性引物參考Dong等和Meng等（表1），引物由南京金斯瑞生物科技有限公司提供。PCR反應(yīng)所用的試劑購(gòu)買于大連寶生生物公司。

將挑出的石榴根結(jié)單卵塊清洗干凈后放入含有無(wú)菌水的凹面皿中，置于26℃恒溫培養(yǎng)箱中分離根結(jié)線蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)待用。以已知的花生根結(jié)線蟲(chóng)MA、南方根結(jié)線蟲(chóng)（Meloidogyne incognita）MI、北方根結(jié)線蟲(chóng)MH、爪哇根結(jié)線蟲(chóng)MJ4種線蟲(chóng)的DNA作為對(duì)照。

為了保證鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性，PCR反應(yīng)所用的DNA模板為單條線蟲(chóng)的DNA樣品。單條線蟲(chóng)的DNA提取參考Wang等、王江嶺等的方法。單條線蟲(chóng)挑入含有8 μL無(wú)菌水的潔凈凹皿中，在解剖鏡下用挑針把線蟲(chóng)切成2-3段：然后把含有線蟲(chóng)的裂解液轉(zhuǎn)移到200 μL的PCR管中，放入液氮中處理5 min，置于65℃水浴3 min（重復(fù)2-3次）：PCR管中加入2 μL的5×裂解緩沖液（10xEx Taq PCR Buffer 100 μL，10μg/L蛋白酶K 10μL，ddH₂O 90μL），65℃加熱1 h，95℃加熱10min，得到DNA。提取液進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.3同工酶分析

酯酶、蘋(píng)果酸脫氫酶操作步驟參照Esbenshade等的研究方法，對(duì)從供試樣本中挑出的成熟雌蟲(chóng)進(jìn)行同工酶電泳分析。以實(shí)驗(yàn)室保存的番茄南方根結(jié)線蟲(chóng)種群作為對(duì)照組。

2.結(jié)果與分析

2.1雌蟲(chóng)會(huì)陰花紋形態(tài)的觀察

供試石榴根結(jié)線蟲(chóng)雌成蟲(chóng)會(huì)陰花紋線紋緊密、波浪狀，呈橢圓或近圓形，無(wú)明顯的側(cè)線，背弓較高，背弓頂部圓或平（圖1）。根據(jù)劉維志的描述，供試根結(jié)線蟲(chóng)樣本屬于南方根結(jié)線蟲(chóng)。

2.2 SCAR-PCR電泳檢測(cè)結(jié)果

由圖2可知，所用的4對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)特異性引物只有南方根結(jié)線蟲(chóng)的特異性引物（MI）從供試樣本中擴(kuò)增出955 bp的條帶（泳道1），和對(duì)照泳道2擴(kuò)增的條帶一致，其余的三對(duì)特異性引物（MH、MA、MJ）沒(méi)能從供試樣本（泳道3、5、7）中擴(kuò)增出特異性條帶，設(shè)置的對(duì)照組（泳道4、6、8）都能擴(kuò)增出相應(yīng)的特異性條帶（1 500、950、517 bp），結(jié)果表明，此枯萎石榴樹(shù)根結(jié)線蟲(chóng)病害的病原物為南方根結(jié)線蟲(chóng)。

2.3同工酶鑒定

供試根結(jié)線蟲(chóng)的酯酶（Est）一條主帶，電泳相對(duì)遷移率（Rm）約0.47，為II型；蘋(píng)果酸脫氫酶（Mdh）為單條酶帶，Rm約0.23，為N1型。蘋(píng)果酸脫氫酶和酯酶的同工酶譜型與對(duì)照線蟲(chóng)南方根結(jié)線蟲(chóng)的譜型完全相同（圖3）。

3.小結(jié)與討論

目前，在中國(guó)危害的根結(jié)線蟲(chóng)類群有39種，其中南方根結(jié)線蟲(chóng)、花生根結(jié)線蟲(chóng)、北方根結(jié)線蟲(chóng)、爪哇根結(jié)線蟲(chóng)4種根結(jié)線蟲(chóng)造成的損失占90%以上。準(zhǔn)確鑒定根結(jié)線蟲(chóng)的類群是開(kāi)展線蟲(chóng)病害防治及其相關(guān)研究的基礎(chǔ)，形態(tài)鑒定法、同工酶譜法、細(xì)胞遺傳學(xué)、分子生物學(xué)等是根結(jié)線蟲(chóng)種類鑒定的常用方法。形態(tài)鑒定法操作方便簡(jiǎn)單，但是種內(nèi)及種間存在變異，鑒定結(jié)果存在一定的不確定性。同工酶譜鑒定法僅對(duì)發(fā)育成熟的雌蟲(chóng)進(jìn)行鑒定，但其可靠性高，在根結(jié)線蟲(chóng)常規(guī)種類鑒定中經(jīng)常使用。基于PCR技術(shù)的分子生物學(xué)鑒定法準(zhǔn)確可靠、檢測(cè)靈敏，適用于線蟲(chóng)各發(fā)育階段，是近年來(lái)發(fā)展較快的根結(jié)線蟲(chóng)鑒定方法。為了避免單一方法鑒定線蟲(chóng)存在的不可靠性，本研究分別采用形態(tài)鑒定法、同工酶譜法、SCAR-PCR法對(duì)棗莊市榴園鎮(zhèn)石榴園的根結(jié)線蟲(chóng)種類進(jìn)行研究，結(jié)果表明，3種方法都鑒定其為南方根結(jié)線蟲(chóng)。周銀麗等對(duì)危害云南石榴的根結(jié)線蟲(chóng)種群鑒定為南方根結(jié)線蟲(chóng)、北方根結(jié)線蟲(chóng)和花生根結(jié)線蟲(chóng)。本研究中采集的樣本經(jīng)鑒定均為南方根結(jié)線蟲(chóng)，在本地區(qū)是否有其他根結(jié)線蟲(chóng)種危害石榴，仍需要在今后的研究中進(jìn)一步擴(kuò)大采樣的范圍。