袁慎俊，胡 衛(wèi)，陳 濤

443002湖北省宜昌市，三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院

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·新進(jìn)展·

RNA干擾在腫瘤治療中的研究進(jìn)展

袁慎俊，胡 衛(wèi)，陳 濤

443002湖北省宜昌市，三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院

【摘要】惡性腫瘤是威脅人類健康的一大殺手，目前所采取的手術(shù)、放化療等治療措施效果并不理想。本文介紹了RNA干擾(RNAi)的相關(guān)作用機(jī)制及其在腫瘤治療中的應(yīng)用，并敘述了RNAi用于治療時(shí)的遞送方式、引起的脫靶效應(yīng)和免疫反應(yīng)，提示RNAi用于治療時(shí)存在的一些問題，通過進(jìn)一步的研究，基于RNAi的腫瘤治療有望成為一種腫瘤治療新方法。

【關(guān)鍵詞】RNA干擾；腫瘤治療方案；脫靶效應(yīng)；免疫反應(yīng)

袁慎俊，胡衛(wèi)，陳濤.RNA干擾在腫瘤治療中的研究進(jìn)展[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2016，19(12)：1367-1370，1374.[www.chinagp.net]

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RNA干擾(RNA interference,RNAi)是指在進(jìn)化過程中高度保守的，由雙鏈RNA(dsRNA)誘發(fā)、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。RNAi使特定基因沉默，是真核細(xì)胞中的一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機(jī)制，這種由21～23個(gè)核苷酸長度介導(dǎo)的小RNA常被稱為小干擾RNA(siRNA)，其序列在真核生物進(jìn)化中高度保守。將長dsRNA或短siRNA遞送進(jìn)入生物體細(xì)胞內(nèi)均可引發(fā)RNAi,進(jìn)而使特定基因表達(dá)沉默。RNAi能夠在真核生物細(xì)胞中抑制特定基因的表達(dá)，產(chǎn)生類似基因敲除的作用。

腫瘤是基于RNAi治療的主要靶點(diǎn)之一。許多體內(nèi)外研究表明，RNAi可用于治療單基因疾病和蛋白過度表達(dá)相關(guān)疾病[1]。在腫瘤生長、轉(zhuǎn)移、血管生成和化療等方面，通過RNAi技術(shù)沉默特殊基因的表達(dá)，許多臨床前研究已經(jīng)取得了可喜成果，且Ⅰ期臨床研究正在進(jìn)行中[2-3]。但是將基于RNAi的腫瘤治療應(yīng)用于臨床，有兩個(gè)關(guān)鍵問題亟需解決：首先，如何高效向腫瘤細(xì)胞或組織遞送干擾RNA；其次，如何減少外源性siRNA引起的不良反應(yīng)。

1RNAi的作用機(jī)制

基因的表達(dá)具有選擇性，生物體內(nèi)存在一套R(shí)NA監(jiān)視系統(tǒng)，能通過多種途徑產(chǎn)生異常dsRNA，進(jìn)而干擾基因的表達(dá)。病毒基因、轉(zhuǎn)座子、人工轉(zhuǎn)入基因等外源基因隨機(jī)整合到宿主細(xì)胞基因組內(nèi)，并利用宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄時(shí)常產(chǎn)生一些dsRNA。對(duì)這些dsRNA，宿主細(xì)胞胞質(zhì)中的核酸內(nèi)切酶Dicer能夠?qū)sRNA切割成多個(gè)具有特定長度和結(jié)構(gòu)的小片段RNA(21～23 bp)，即siRNA。siRNA在細(xì)胞內(nèi)RNA解旋酶的作用下解鏈成正義鏈和反義鏈，然后由反義鏈與胞內(nèi)一些酶(包括內(nèi)切酶、外切酶、解旋酶等)結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex，RISC)，RISC再與胞內(nèi)特異性mRNA的同源區(qū)結(jié)合，此時(shí)RISC具有核酸酶的功能，能在結(jié)合部位切割mRNA，切割位點(diǎn)是與siRNA中反義鏈互補(bǔ)結(jié)合的兩端。被切割后的斷裂mRNA隨即降解，進(jìn)而誘發(fā)宿主細(xì)胞針對(duì)這些mRNA的降解反應(yīng)[2](見圖1)。siRNA不僅能引導(dǎo)RISC切割同源單鏈mRNA，而且可作為引物與同源RNA結(jié)合并在RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP)作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer酶切割產(chǎn)生大量次級(jí)siRNA，進(jìn)而產(chǎn)生RNAi的放大效應(yīng)，最終將更多的靶mRNA降解。

注：dsRNA=雙鏈RNA，siRNA=小干擾RNA，RISC=沉默復(fù)合物

圖1長dsRNA被Dicer酶切割成siRNA，繼而siRNA的反義鏈與一些酶形成RNA誘導(dǎo)的RISC，再由RISC切割mRNA誘導(dǎo)其降解

Figure 1Long dsRNA was cut into siRNA by Dicer enzyme,and antisense strand of siRNA and some enzymes formed RNA-induced silencing complex (RISC),then RISC was used to cut mRNA to induce its degradation

2RNAi在腫瘤治療中的應(yīng)用

腫瘤發(fā)生是多個(gè)基因相互調(diào)控、作用“失靈”的結(jié)果，當(dāng)前對(duì)腫瘤的保守治療主要是通過物理或化學(xué)的方法抑制DAN復(fù)制及細(xì)胞分裂增殖，進(jìn)而殺死癌細(xì)胞，然而這些方法不可能完全抑制或逆轉(zhuǎn)腫瘤生長。RNAi可以利用同一基因家族的多個(gè)基因具有一段同源性很高的保守序列這一特性，設(shè)計(jì)針對(duì)這一序列的dsRNA分子，只導(dǎo)入一種dsRNA即可使胞內(nèi)多個(gè)基因同時(shí)沉默，從而促使癌細(xì)胞生長停滯。在RNAi治療中將抑制序列選擇在特定位點(diǎn)，可對(duì)部分有明確基因突變的癌細(xì)胞產(chǎn)生誘導(dǎo)凋亡作用。Rothdiener等[3]研究了一種脂質(zhì)體siRNA載體系統(tǒng)，用于靶向遞送siRNA到CD33陽性急性髓性白血病細(xì)胞中，其siRNA是針對(duì)t(8；21)易位導(dǎo)致的AML1/ MTG8融合基因，結(jié)果顯示，siRNA能減少AML1/MTG8相關(guān)的mRNA和蛋白表達(dá)水平，降低急性髓性白血病細(xì)胞克隆增殖。此外，可通過使用腫瘤特異性啟動(dòng)子如人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)、Survivin、環(huán)氧合酶2(COX-2)等引導(dǎo)針對(duì)某些癌基因或抗凋亡分子的siRNA或短發(fā)夾RNA(shRNA)進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，進(jìn)而達(dá)到特異性殺傷腫瘤細(xì)胞的目的。Xu等[4]開發(fā)了一種siRNA表達(dá)盒用于篩選高效靶向性RNA干擾序列，用于肝癌的基因治療，8種hTERT特異性SECs(SEC-1～8)被成功構(gòu)建，與陰性對(duì)照的SEC比較，hTERT特異性SECs能明顯減少HepG2細(xì)胞中hTERT活性，明顯降低hTERT相關(guān)的mRNA和蛋白表達(dá)水平，通過SECs下調(diào)hTERT基因表達(dá)可引起HepG2細(xì)胞凋亡。

盡管化療藥物能有效殺滅腫瘤細(xì)胞，但對(duì)腫瘤細(xì)胞靶向性較差，在應(yīng)用化療藥物治療腫瘤的同時(shí)，也會(huì)殺傷較多正常細(xì)胞。實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的靶向性同樣也是以 RNAi為基礎(chǔ)的腫瘤治療的重要發(fā)展方向。針對(duì)不同基因的RNAi可有效抑制腫瘤細(xì)胞生長，這些靶基因包括：B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)、Survivin、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、表皮生長因子受體(EGFR)等。此外，RNAi還有化療增敏作用，Zhou等[5]研究發(fā)現(xiàn)，蛋白激酶B(Akt)是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，與胃癌化療敏感性相關(guān)，通過RNAi技術(shù)將Akt1沉默慢病毒轉(zhuǎn)入胃癌細(xì)胞株SGC-7901和BGC-823中,可顯著提高細(xì)胞株對(duì)順鉑的敏感性。RNAi代替?zhèn)鹘y(tǒng)反義核酸進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后沉默基因，能高效特異地抑制目的基因表達(dá)，并且還可以根據(jù)患者不同病情，設(shè)計(jì)出個(gè)體化的治療方案。

3RNAi的理想遞送系統(tǒng)

由于siRNA的分子量較大和帶有負(fù)電荷，不能輕易跨越癌細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，因此將siRNA高效、特異性遞送進(jìn)入靶細(xì)胞或組織已成為RNAi技術(shù)的主要挑戰(zhàn)之一。目前各種RNAi遞送系統(tǒng)已被開發(fā)，例如納米顆粒、基于脂質(zhì)的制劑、絡(luò)合聚陽離子[6]和病毒載體等，并在小鼠和非人靈長類動(dòng)物模型中實(shí)驗(yàn)。然而，這些方法均不能將siRNA特異性遞送進(jìn)入癌細(xì)胞，有些siRNA只在典型應(yīng)用中才起作用，或者存在細(xì)胞毒性或潛在的免疫原性。

siRNA遞送的一個(gè)重要進(jìn)展是成功應(yīng)用適配體——RNAi的嵌合體。適配體能與多種目標(biāo)物質(zhì)高特異性、高選擇性結(jié)合。例如，適配體可與前列腺癌細(xì)胞膜表面抗原(PSMA)的胞外域特異性結(jié)合，能夠高效遞送siRNA靶向前列腺癌的致癌基因。給予靶向PSMA-Plk1的siRNA或靶向PSMA-Bcl2的siRNA，可以導(dǎo)致前列腺癌異種移植腫瘤的小鼠腫瘤縮小[7]。另一種將siRNA遞送進(jìn)入細(xì)胞的方法是穩(wěn)定核酸脂質(zhì)復(fù)合物(SNALPs)[8],對(duì)脂類復(fù)合物進(jìn)行聚乙二醇(PEG)修飾使得復(fù)合物獲得親水性外層，從而增強(qiáng)其在血漿中的穩(wěn)定性。SNALPs還可荷載siRNA和改善細(xì)胞對(duì)siRNA的攝取及胞內(nèi)釋放。應(yīng)用SNALPs來遞送siRNA，其siRNA的效應(yīng)能持續(xù)>2周，誘導(dǎo)>90%的靶基因沉默，并且無任何毒副作用[9]。Di Martino等[10]證明膠囊化SNALPs遞送miR-34a顯示出了高效遞送和基因調(diào)節(jié)效率，并且沒有全身毒性，SNALP中的miR-34a在體內(nèi)和體外均能高效抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞生長。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)磷酰胺(CTX)耦合的靶向性納米粒子SNALPs能夠選擇性結(jié)合神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，對(duì)于非腫瘤細(xì)胞不具有親和性。此外，RNAi納米粒子介導(dǎo)的miR-21沉默在體內(nèi)、外能夠抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖[11]。另一特異性靶向遞送方式是使用魚精蛋白抗體融合蛋白。ErbB2特異性單鏈抗體與魚精蛋白融合的重組融合蛋白能夠允許靶向ErbB2的siRNA進(jìn)入ErbB2陽性的乳腺癌細(xì)胞[12]。注射F105-P(融合蛋白)包被的siRNAs靶向致癌基因c-myc、MDM2和VEGF,能夠有效降低人類免疫缺陷病毒(HIV)表達(dá)陽性B16黑色素瘤細(xì)胞增殖，但對(duì)正常組織或HIV表達(dá)陰性B16細(xì)胞沒有作用。

病毒載體通常用于遞送包括慢病毒、腺病毒、雙鏈腺相關(guān)病毒(AAVs)和皰疹病毒在內(nèi)的shRNAs或miRNAs[13-14]。腺相關(guān)病毒(AAV)由于低病原性和基因持續(xù)表達(dá)的特性成為了基因運(yùn)輸工具。Sun等[15]揭示AAV-ARHP8病毒能夠大幅度減少雄激素受體(AR)調(diào)控的胞內(nèi)存活基因表達(dá)和引發(fā)凋亡反應(yīng)，瘤內(nèi)注射AAV-ARHP8病毒能顯著抑制異種移植腫瘤的生長。大部分腫瘤細(xì)胞在基因轉(zhuǎn)錄時(shí)能夠表達(dá)hTERT，利用hTERT能提高AAV對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向性,hTERT啟動(dòng)子引導(dǎo)的TRAIL基因表達(dá)能夠抑制腫瘤生長，因此AAV-hTERT-TRAIL復(fù)合物將是有效的抗腫瘤藥物[16]。在動(dòng)物模型中，瘤內(nèi)注射AAV-hTERT-TRAIL能顯著抑制移植腫瘤的生長和導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡[16]。此外，通過外部磁場將攜帶有磁性納米粒子的藥物富集在腫瘤內(nèi)，可以防止納米粒子在到達(dá)腫瘤部位之前被代謝清除，因此，攜帶納米粒子的磁性靶向藥物被認(rèn)為是一種新的腫瘤治療藥物[17]。

還有一些新的遞送系統(tǒng)可以提高siRNA通過全身遞送系統(tǒng)進(jìn)入腫瘤區(qū)或提高靶向腫瘤細(xì)胞的特異性和有效性，如使用PEG聚乙二醇化，腫瘤特異性配體修飾的納米粒子結(jié)合光、熱或pH敏感組件等[18]。

4RNAi存在的問題

以細(xì)胞培養(yǎng)為基礎(chǔ)研究RNAi的相關(guān)藥物，這些藥物已用于臨床，并表現(xiàn)出與傳統(tǒng)藥物相比極大的優(yōu)勢。然而，近來發(fā)現(xiàn)這些藥物應(yīng)用于臨床面臨著幾個(gè)問題。雖然開發(fā)的許多載體系統(tǒng)提高了siRNA遞送到靶細(xì)胞的效率，但存在一些RNAi的安全性問題，特別是脫靶效應(yīng)和內(nèi)在免疫反應(yīng)[19]。

4.1克服RNAi的脫靶效應(yīng)siRNA可引起一些非靶基因的非特異性沉默或表達(dá)上調(diào)，引起細(xì)胞凋亡或生長抑制，這種現(xiàn)象稱為脫靶效應(yīng)。脫靶效應(yīng)siRNA序列進(jìn)入microRNA途徑，通過microRNA，干擾RNA可以不受完全互補(bǔ)限制而調(diào)控大量靶基因表達(dá)。原本需要19～23 nt的RNA序列完全互補(bǔ)才能發(fā)生干擾效應(yīng)，而如果進(jìn)入microRNA途徑，只需要11～15 nt互補(bǔ)就可以產(chǎn)生干擾作用，這使得siRNA可能與非靶基因結(jié)合而導(dǎo)致非靶基因沉默，造成脫靶效應(yīng)。脫靶效應(yīng)發(fā)生時(shí)，與靶基因有相似序列的基因也被抑制[20]。參與這一作用的機(jī)制是靶向干擾性siRNA與特異性mRNA不完全互補(bǔ)[21]。從治療觀點(diǎn)看，脫靶效應(yīng)可能會(huì)嚴(yán)重限制siRNA在未來作為治療劑的應(yīng)用。

解決脫靶效應(yīng)的潛在方法：(1)最大限度地減少脫靶效應(yīng)，包括最新發(fā)現(xiàn)的siRNA領(lǐng)域轉(zhuǎn)移優(yōu)化策略。配體識(shí)別細(xì)胞特異性受體可用來遞送基于RNAi的藥物靶向癌細(xì)胞和避免脫靶效應(yīng)，因?yàn)榭贵w具有高親和力和能選擇性與癌組織中的生物標(biāo)志物結(jié)合[22]。Burks等[23]和Zucker等[24]將重組Fab′片段連附到阿霉素脂質(zhì)體制劑上用來治療人表皮生長因子受體-2(HER-2)過表達(dá)的乳腺癌。(2)改變siRNA的濃度，Caffrey等[25]針對(duì)己糖激酶Ⅱ的siRNA治療，發(fā)現(xiàn)其有濃度依賴性的脫靶效應(yīng)，脫靶及其相關(guān)表型效應(yīng)可減少siRNA的用量，而這些siRNA在低濃度(如1 nmol/L)時(shí)也能高效沉默靶基因。(3)siRNA設(shè)計(jì)，Xu等[26]觀察到一些脫靶相關(guān)基因在多種基因的3′UTR中存在。3′UTR的脫靶相關(guān)基因可以在siRNA的設(shè)計(jì)中加以考慮，以減少RNAi治療誘發(fā)的脫靶效應(yīng)。為了驗(yàn)證全基因組熱力學(xué)分析能夠精確地識(shí)別潛在的脫靶基因和幫助減少siRNA引發(fā)的脫靶效應(yīng)，Chen等[27]設(shè)計(jì)了針對(duì)3種人類基因IDH1、ITPR2和TRIM28的2種siRNA，并且其中1種基因通過全基因組熱力學(xué)分析工具(Picky)預(yù)測包含有脫靶基因且能引發(fā)脫靶效應(yīng)，這項(xiàng)研究表明經(jīng)過Picky預(yù)測沒有脫靶基因的siRNA不可能導(dǎo)致脫靶效應(yīng)。因此，在siRNA的設(shè)計(jì)中Picky是必不可少的篩選步驟。

4.2克服RNAi引起的免疫反應(yīng)siRNAs還是哺乳動(dòng)物固有免疫系統(tǒng)的有力激活劑，尤其在治療疾病時(shí)重復(fù)給藥。全身給藥后，siRNA雙鏈能誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的炎性細(xì)胞因子和Ⅰ型干擾素。影響siRNA免疫識(shí)別的因素包括：敏感細(xì)胞類型、運(yùn)載工具、siRNA序列和結(jié)構(gòu)，并且激活固有免疫反應(yīng)可引起假陽性療效和急性毒性[28]。免疫系統(tǒng)由許多子白細(xì)胞構(gòu)成，每個(gè)子細(xì)胞在體內(nèi)均有其自身的特點(diǎn)和獨(dú)特的位置，這為RNAi提供了一個(gè)多樣的靶點(diǎn)，每一個(gè)靶點(diǎn)將是一個(gè)新的挑戰(zhàn)和潛在的治療策略。

為了最大限度地減少由siRNA誘發(fā)的免疫反應(yīng)，可用免疫刺激的siRNA來避免誘發(fā)的相關(guān)免疫反應(yīng)，因此通過選擇缺乏免疫刺激基序的序列，能夠設(shè)計(jì)出無免疫刺激活性的siRNA。然而，缺乏對(duì)免疫刺激RNA序列基序性質(zhì)的了解，極大限制了設(shè)計(jì)出針對(duì)一個(gè)特定靶點(diǎn)的新siRNA序列。通過化學(xué)修飾來穩(wěn)定siRNA雙鏈?zhǔn)且粋€(gè)經(jīng)典方法，可以極大減少由siRNA引起的免疫反應(yīng)。Valenzuela等[29]發(fā)現(xiàn)用核糖修飾的方式(如2′-OMe或者 2′-F)引起免疫刺激的siRNA序列，能夠減少細(xì)胞因子的產(chǎn)生，并且這種作用在5′端修飾比3′端更加明顯。Wu等[30]的結(jié)果顯示，通過靶向包含1B的GRAM域(GRAMD1B，參與化學(xué)抗性的一種蛋白質(zhì))，用2′-OMe-phosphorodithioate修飾的siRNA治療化療耐藥卵巢癌小鼠，與紫杉醇聯(lián)用可以產(chǎn)生協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)。減少siRNA誘發(fā)的固有免疫反應(yīng)的另一種方式是通過封裝方法來穩(wěn)定siRNA分子。研究表明，脂質(zhì)體、聚合物、微乳液和納米凝膠、PEI(具有高陽離子電荷密度，帶有多個(gè)氨基的有機(jī)分子)、CDs(a-1,4連接的吡喃葡糖基天然環(huán)狀低聚物)和藻酸鹽可用于包被siRNA[31]。這些方法的應(yīng)用將極大減少siRNA誘發(fā)的免疫反應(yīng)。

5小結(jié)和展望

RNAi是一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制，通過RNAi技術(shù)可以特異性剔除或關(guān)閉特定基因的表達(dá)，進(jìn)而為惡性腫瘤的治療提供一種新的思路。其優(yōu)勢在于簡便、高效、特異。但是將基于RNAi的基礎(chǔ)研究向臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化，還存在一些問題有待解決，需要進(jìn)一步研究。

由于RNAi技術(shù)可以利用siRNA或siRNA表達(dá)載體經(jīng)濟(jì)、快速、簡便的以序列特異方式沉默目的基因，所以已成為探索基因功能的重要研究手段。同時(shí)大量與腫瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn)，為RNAi技術(shù)應(yīng)用于腫瘤治療奠定了基礎(chǔ)。盡管在臨床應(yīng)用中，RNAi治療存在脫靶效應(yīng)、免疫反應(yīng)等問題，但這些問題最終會(huì)得以解決?？傊?，可以預(yù)測基于RNAi的腫瘤治療在不久的將來有望成為一種腫瘤臨床治療新方法。

作者貢獻(xiàn)：袁慎俊進(jìn)行資料收集整理、撰寫論文、成文并對(duì)文章負(fù)責(zé)；胡衛(wèi)進(jìn)行資料收集及評(píng)估；陳濤進(jìn)行質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：李婷婷)

Progress of RNAi Technology for Cancer Therapy

YUANShen-jun，HUWei，CHENTao.TheMedicalCollegeofThreeGorgesUniversity,Yichang443002,China

【Abstract】Malignant tumors are a major threat to human health,and at present the primary types of treatment such as surgery,radiation and chemotherapy do not have a good effect.This text introduced the mechanism of RNA interference (RNAi) and the application of RNAi technology in cancer therapy,described drug delivery methods of RNAi in the therapy,RNAi-induced off-target effects and immune response.Although problems still exist in the treatment by RNAi,RNAi-based cancer therapy may be a new method for the clinical treatment of cancer by further research.

【Key words】RNA interference；Antineoplastic protocols；Off-target effects；Immune response

(收稿日期：2015-11-29；修回日期：2016-01-26)

【中圖分類號(hào)】R 730.5 R 394.114

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.12.002

通信作者：陳濤，443002湖北省宜昌市，三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院；

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81173612)

E-mail：chentao@ctgu.edu.cn