， ， ， ， (.江蘇大學(xué)生命科學(xué)研究院， 江蘇 鎮(zhèn)江 03;.州市農(nóng)水畜禽產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)中心， 江蘇 州 003)

水稻愈傷分化和再生研究進(jìn)展

朱克明1，陶慧敏1，徐碩1，端禮欽2，楊艷華1
(1.江蘇大學(xué)生命科學(xué)研究院， 江蘇 鎮(zhèn)江 212013;2.徐州市農(nóng)水畜禽產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)中心， 江蘇 徐州 221003)

水稻是我國最重要的糧食作物，維持著超過半數(shù)人口的生存。轉(zhuǎn)基因技術(shù)是水稻產(chǎn)量提高和質(zhì)量提升的一個(gè)重要工具。然而，秈稻中大多數(shù)品種由于愈傷誘導(dǎo)困難以及分化率低，限制了轉(zhuǎn)基因技術(shù)在秈稻中的應(yīng)用。本文綜述了基因型、外植體來源、培養(yǎng)基和外源激素對(duì)秈稻愈傷誘導(dǎo)和分化的影響，以及調(diào)控愈傷分化和再生的基因，為今后秈稻品種的進(jìn)一步遺傳改良提供理論依據(jù)。

水稻； 愈傷組織； 組織培養(yǎng)； 轉(zhuǎn)基因； 秈稻

水稻是禾本科模式植物，也是最重要的糧食作物之一，養(yǎng)活了全世界一半以上的人口[1]。但是隨著世界人口的不斷增加，糧食供求也越來越緊張。目前，主要通過傳統(tǒng)育種提高水稻的產(chǎn)量，但是轉(zhuǎn)基因育種具有周期短、適用對(duì)象廣等特點(diǎn)。由于粳稻品種愈傷分化和植株再生率較高，轉(zhuǎn)基因育種在粳稻中已取得了可喜的成果，但是占整個(gè)水稻品種的80%以上的秈稻，由于愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生率低造成遺傳轉(zhuǎn)化困難，嚴(yán)重地制約了轉(zhuǎn)基因技術(shù)在秈稻中的應(yīng)用[2-3]。本文主要從影響水稻愈傷分化和再生因素以及調(diào)控基因等方面的研究進(jìn)行綜述。

1 水稻遺傳轉(zhuǎn)化

水稻遺傳轉(zhuǎn)化采用最多的體系為愈傷組織再生系統(tǒng)，水稻體細(xì)胞組織培養(yǎng)作為水稻基因工程的基礎(chǔ)技術(shù)，在水稻遺傳改良中具有重要的作用。利用愈傷組織再生系統(tǒng)具有以下優(yōu)點(diǎn)： 1) 外植體來源廣泛； 2) 繁殖速度快； 3) 易于接受外源基因； 4) 轉(zhuǎn)化效率高[4]。自從1965年，Amemiya等開始水稻組織培養(yǎng)，幾十年來，各國研究者先后從水稻各部位誘導(dǎo)出愈傷組織和再生植株[4]。同時(shí)發(fā)明了多種轉(zhuǎn)化技術(shù)和方法，主要有基因槍法、PEG法、電融合法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、花粉管通道法、激光介導(dǎo)法和DNA吸收法。其中農(nóng)桿菌介導(dǎo)法具有轉(zhuǎn)基因低拷貝、遺傳穩(wěn)定、能夠轉(zhuǎn)化大片段的以及操作簡(jiǎn)便易行，成本低等優(yōu)點(diǎn)，已成為水稻遺傳轉(zhuǎn)化的首選方法，并已形成了較穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體系，逐漸進(jìn)入了實(shí)用化階段，成為農(nóng)作物品種改良的重要方法之一[4-8]。

在水稻中，早在20世紀(jì)80年代初期就利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻。Baba等將農(nóng)桿菌原生質(zhì)球與水稻原生質(zhì)體通過PEG法融合，部分水稻愈傷組織能夠合成胭脂堿，表明轉(zhuǎn)基因成功[9]。Chan等[10]首次利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻，但當(dāng)時(shí)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)有一些問題，而且沒有進(jìn)行分子驗(yàn)證，因此人們對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻持懷疑態(tài)度。直到20世紀(jì)90年代，Hiei等利用“超雙元”載體，并且將乙酞丁香酮等幫助轉(zhuǎn)化的物質(zhì)加入培養(yǎng)基中，使得轉(zhuǎn)化率大幅度提高，而且也進(jìn)行了分子生物學(xué)和遺傳學(xué)驗(yàn)證[11-12]。此后，水稻的遺傳轉(zhuǎn)化大量應(yīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。例如， Dong等(1996)利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得了轉(zhuǎn)基因的爪哇稻植株[13]。劉巧泉等也利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻，獲得了轉(zhuǎn)基因粳稻植株[4,14]。目前秈稻已有通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化成功的報(bào)道[15-17]，但這些轉(zhuǎn)化系統(tǒng)要么轉(zhuǎn)化效率低，要么只適用于有限的秈稻品種，這主要是由于秈稻品種的愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生的能力與粳稻品種存在差異。

2 影響水稻愈傷分化和再生的因素

2.1 基因型

影響水稻愈傷組織誘導(dǎo)的主要因素是材料的基因型。目前研究表明，在水稻花藥培養(yǎng)中，接種材料的基因型是影響花藥培養(yǎng)再生植株的最主要因素，一般以粳稻培養(yǎng)的再生率最高，花藥愈傷組織培養(yǎng)力高低的順序：粳/粳gt;粳gt;粳/秈gt;秈/秈gt;秈[3,18-19]。基因型也同樣控制著成熟胚的分化率，研究表明，粳稻與秈稻在愈傷組織誘導(dǎo)率及分化率上存在差異，粳稻(96.07%～41.33%)要明顯好于秈稻(89.71%～15.61%)[3,20]。Abe和Futsuhara檢測(cè)了66個(gè)秈稻和粳稻栽培品種，發(fā)現(xiàn)這些品種愈傷組織誘導(dǎo)能力截然不同[21]。與粳稻相比，秈稻愈傷組織的誘導(dǎo)能力和分化率都比粳稻差；即使在秈稻亞種內(nèi)，其愈傷組織的誘導(dǎo)能力因基因型不同而存在差異[21-24]。

水稻基因型不僅控制水稻愈傷組織的誘導(dǎo)率，而且也決定水稻愈傷組織的再生率。其它物種，植物組織再生率的分子機(jī)理研究早有報(bào)道。早在1975年，Bingham等報(bào)道不同三葉草品種有不同的再生率(RR)，通過回交技術(shù)可以將高性狀RR特性從一個(gè)品種轉(zhuǎn)移到其它品種[25]。其他實(shí)驗(yàn)室的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，三葉草的RR性狀是由幾個(gè)基因共同控制的[26-28]。水稻愈傷組織再生率的研究也取得了很大的進(jìn)展。Abe和Futsuhara對(duì)水稻成熟胚培養(yǎng)的愈傷組織再生率進(jìn)行了雙列雜交分析，結(jié)果表明，愈傷組織再生率與2個(gè)基因有關(guān)，廣義和狹義遺傳力分別為01978和01933，而且在Kuju×Somewake的F2中，他們觀察到了低、高愈傷組織再生率個(gè)體呈3∶1的分離[29]。Taguchi-Shiobara比較分析水稻的再生率，發(fā)現(xiàn)Aus 373和Kassalath的愈傷組織再生率和再生苗數(shù)差異顯著，表明顯性基因具有提高再生率的作用[30]。這些研究表明，水稻愈傷組織的再生率也是由基因型決定的。

2.2 外植體來源

不同的外植體對(duì)水稻愈傷組織形成和植株再生影響很大。花藥，幼穗，幼胚及成熟胚都是水稻常用的外植體，但是不同組織的愈傷誘導(dǎo)率和分化率不同。Li Z等研究表明，來自美國長穗品種Labell的未成熟胚的愈傷組織的生長速率和植株再生率高于其它外植體的愈傷組織[31]。王秀紅等對(duì)水稻不同外植體愈傷誘導(dǎo)及綠苗分化率進(jìn)行了研究，表明成熟胚、幼穗和幼胚的愈傷組織的誘導(dǎo)率高于花藥；而幼胚和幼穗的綠苗分化率沒有明顯差異，但比成熟胚和花藥都高，而花藥的綠苗分化率是最低[32]。而鄭文靜等研究表明，成熟胚為外植體時(shí)誘愈率最高，幼穗和幼胚為外植體誘愈率次之，雜交組合的花藥的愈傷誘導(dǎo)率比常規(guī)品種高[33]。通過優(yōu)化誘導(dǎo)和繼代條件，秈稻9311成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)率也能達(dá)到87.5%，綠苗分化率也有46.7%；而秈稻的花藥培養(yǎng)力一般比較低，愈傷誘導(dǎo)率平均約為0.5%，不超過5%，綠苗誘導(dǎo)率在20%以下[34]。總之，未分化幼胚和幼穗易獲得再生能力強(qiáng)的愈傷組織，因此是比較理想的遺傳轉(zhuǎn)化受體。但是幼胚和幼穗受到生長季節(jié)限制，而且數(shù)量也受到群體規(guī)模的制約，這些因素制約著遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中大量愈傷組織的需要；而成熟胚取材不受季節(jié)限制、操作簡(jiǎn)便，可以持續(xù)不斷地提供轉(zhuǎn)化受體[3,11]。

2.3 培養(yǎng)基

水稻常用培養(yǎng)基為N 6、MS、AA和1/2 MS等。其中AA主要用于水稻懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，1/2 MS主要用于生根培養(yǎng)[35]。N 6和MS培養(yǎng)基在外源激素存在下都能誘導(dǎo)成熟胚分化形成愈傷組織，但愈傷組織的質(zhì)量和誘導(dǎo)率有差異[3]。張智奇等利用MS和N 6培養(yǎng)基分析了水稻幼穗的愈傷組織誘導(dǎo)以及植株再生，表明N 6分化培養(yǎng)基比MS培養(yǎng)基更有效地促進(jìn)植株再生[35-36]。張堯忠等的研究結(jié)果也表明，愈傷組織在N 6分化培養(yǎng)基的再生綠苗率高于MS培養(yǎng)基[35,37]。秈稻品種的成熟胚在以N 6大量元素、B 5微量、有機(jī)元素組合成NB培養(yǎng)基以及N 6大量元素、MS微量元素、B 5有機(jī)成分組合成NMB培養(yǎng)基都能誘導(dǎo)較好的愈傷組織，此外將NB和NMB組合起來使用比單獨(dú)用效果更好，能誘導(dǎo)更多的胚性愈傷組織，而且胚性較強(qiáng)、生長和分裂十分旺盛、分化率較高[35,38-39]。

蔗糖是水稻組織培養(yǎng)基中最基本、最常用的碳源。蔗糖濃度主要根據(jù)不同的外植體來添加，如花粉為60 g/L、幼穗為40 g/L、成熟胚為30 g/L。李霞等分析了秈稻成熟胚在不同濃度蔗糖下的愈傷誘導(dǎo)率和質(zhì)量，研究表明，適當(dāng)增加蔗糖可以提高成熟胚的愈傷誘導(dǎo)率，并提高愈傷質(zhì)量[35,40]。

以上研究表明，來自水稻不同的外植體對(duì)分化培養(yǎng)基中各種組成成分的需求不同，因此在實(shí)驗(yàn)過程中需要根據(jù)不同基因型和組織對(duì)培養(yǎng)基組成成分進(jìn)行搭配，從而獲得較為理想的培養(yǎng)效果。

2.4 激 素

激素是影響水稻愈傷組織分化及綠苗誘導(dǎo)的關(guān)鍵性因子。其中生長素2,4-D是誘導(dǎo)胚性愈傷組織不可缺少的激素，研究表明，0.5 mg/L 6-BA(細(xì)胞分裂素)與2. 0 mg/L 2,4-D配合誘導(dǎo)率最高[41-42]。而秈稻誘導(dǎo)愈傷組織，在使用了2,4-D和6-BA的基礎(chǔ)上添加NAA(萘乙酸)、KT(激動(dòng)素)、ABA(脫落酸)等激素，能明顯促進(jìn)秈稻的成愈率、愈傷組織質(zhì)量。田文忠等研究發(fā)現(xiàn)，秈稻的胚在只含有2,4-D的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)的愈傷組織呈黏液化，比較松軟，不易分化，而且再生率不到10%；而在培養(yǎng)基中添加NAA和KT 2種激素后，可以顯著改變愈傷組織，愈傷組織比較硬和致密，并呈顆粒狀，而且有助于提高秈稻的再生率[35,43]。ABA對(duì)秈稻愈傷組織誘導(dǎo)及保持愈傷組織胚性有一定作用，低濃度的ABA能明顯改進(jìn)愈傷的生長狀態(tài)，過高的ABA對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)不利，導(dǎo)致愈傷變軟，甚至粘液化[44]。

3 調(diào)控愈傷分化和再生的基因

植物組織培養(yǎng)是植物遺傳轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)，其分子調(diào)控機(jī)理一直是研究熱點(diǎn)。對(duì)水稻、玉米、小麥、大麥等植物的大量研究表明，植物的組織培養(yǎng)力是由數(shù)量性狀位點(diǎn)控制的[45-50]。這些研究結(jié)果都表明，植物組織的愈傷誘導(dǎo)率及再生率可能是由QTLs控制的。目前，QTL定位是研究水稻的愈傷組織分化和再生基因的重要手段。Zhang等通過研究高水稻再生率品種Aikoku與低再生率品種Moritawase構(gòu)建的群體，在高再生率品種Aikoku中找到了1個(gè)控制高再生率的顯性基因[51]。他們隨后在水稻品種Joshu中也找到了1個(gè)控制高再生率的顯性基因以及1個(gè)隱性基因，該顯性基因與Aikoku中的高再生率基因是等位的[51]。Taguchi-Shiobara等對(duì)秈稻品種Kasalath和粳稻品種Nipponbare雜交后代群體的再生率進(jìn)行了QTL定位，表明存在控制再生率的QTL[52]。之后Taguchi-Shiobara等又用Kasalath和Koshihikari及其雜交群體后代對(duì)水稻愈傷組織培養(yǎng)性進(jìn)行QTL分析，在染色體1號(hào)、4號(hào)和9號(hào)上發(fā)現(xiàn)了8個(gè)水稻愈傷組織培養(yǎng)性(包括愈傷組織的顏色，質(zhì)量，繼代能力和體積)相關(guān)的QTLs位點(diǎn)，但沒有發(fā)現(xiàn)主效QTL[3,53-54]。Kwon等通過“密陽23”和粳稻品種“Gihobyeo”構(gòu)建的重組自交群體發(fā)現(xiàn)2個(gè)位于染色體1和2上的QTLs控制愈傷組織誘導(dǎo)的，而位于2號(hào)、3號(hào)和11號(hào)染色體上的4個(gè)QTLs控制愈傷組織的再生率[55]。He等建立一個(gè)從秈/粳雜種加倍單倍體(DH)群體用于SK 3培養(yǎng)基培養(yǎng)，在1號(hào)、6號(hào)、7號(hào)、8號(hào)、9號(hào)、10號(hào)和12號(hào)染色體上檢測(cè)到7個(gè)QTLs，主要包括愈傷組織誘導(dǎo)頻率，綠苗分化頻率，白化苗分化頻率和綠苗產(chǎn)率4種性狀[56]。Li等研究了140個(gè)93-11和日本晴的重組自交系(RILs)，共獲得25個(gè)QTLs，分別控制愈傷顏色、大小、松緊、誘導(dǎo)率、褐化率和綠苗產(chǎn)率[57]。但這些研究都沒有克隆到愈傷誘導(dǎo)和分化的主效QTLs。

Nishimura等利用再生性差異明顯的水稻品種Kasalath(高再生)和Koshihikari(低再生)雜交后代群體的再生率進(jìn)行QTL定位，圖位克隆到1個(gè)再生相關(guān)的主效QTL，其編碼一個(gè)鐵氧化還原蛋白亞硝酸鹽還原酶(NiR, ferredoxin nitrite reductase)，并能夠從高再生率的Kasalath品種轉(zhuǎn)移至低再生率的Koshihikari品種中[58]。研究表明，在培養(yǎng)Koshihikari愈傷組織的培養(yǎng)基中亞硝酸鹽比較多，而在培養(yǎng)Kasalath愈傷組織的培養(yǎng)基中亞硝酸鹽含量極少，這表明Kasalath中的亞硝酸還原酶促進(jìn)了細(xì)胞內(nèi)的亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化，從而減少了培養(yǎng)基中亞硝酸鹽的積累，對(duì)細(xì)胞自身的傷害降低，促進(jìn)植株的再生。Ozawa等在高再生品種Konansou的NiR基因啟動(dòng)子中發(fā)現(xiàn)重復(fù)序列 (5’-GCATCTGCCCTTTTGAATTCGCCA-3’)，使NiR表達(dá)高于低再生品種Koshihikari達(dá)3倍之多[59]。以上研究表明，亞硝酸鹽還原酶在水稻植株再生率中發(fā)揮重要作用，NiR蛋白的量及活性是影響水稻植株再生率的主要因素。

Somatic Embryogenesis Receptor-like Kinase (SERK)是在胡蘿卜中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)調(diào)控體細(xì)胞向胚性細(xì)胞轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵蛋白[60]。SERK蛋白的結(jié)構(gòu)分析表明，SERK蛋白是由信號(hào)肽(N端)、5個(gè)LRR域(1eucine-rich repeat domain)、LZ域(1eucine zipper)、11個(gè)保守的Ser/Thr激酶功能域、1個(gè)SPP基序以及1個(gè)類似LRR的C端區(qū)組成，是屬RLK(receptor-like kinases)家族。OsSERKl是水稻同源基因，其主要在水稻旗葉和愈傷組織中的表達(dá)，OsSERKl過表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻的再生率明顯高于野生型，OsSERKl干擾的轉(zhuǎn)基因水稻的再生率顯著低于野生型[61]。

4 問題和展望

植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)已經(jīng)取得了巨大成就，是研究植物基因功能必不可少的工具。特別是近幾年發(fā)展的TALEN和CRISPR/Cas技術(shù)在轉(zhuǎn)基因中的應(yīng)用，使培育無抗生素標(biāo)記基因(GFP或PMI)的轉(zhuǎn)基因植物成為可能。目前限制轉(zhuǎn)基因技術(shù)在水稻中應(yīng)用的主要因素是水稻品種的遺傳轉(zhuǎn)化效率，其很大程度上取決于水稻的組織培養(yǎng)性。而水稻愈傷組織的誘導(dǎo)和植株再生能力取決于多因素，如受體植物的基因型，外植體的類型和生理狀態(tài)，培養(yǎng)基中鹽、有機(jī)物以及植物激素組成和濃度。近年來，粳稻高效組織培養(yǎng)體系的建立大大加快了轉(zhuǎn)基因在粳稻品種的應(yīng)用推廣，然而秈稻品種占整個(gè)水稻品種80%以上，由于愈傷組織誘導(dǎo)困難以及植株再生率較低，導(dǎo)致其遺傳轉(zhuǎn)化成功率低。目前雖然已經(jīng)獲得了幾個(gè)調(diào)控水稻愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生的QTLs，但其分子調(diào)控機(jī)制尚不完全清楚。但是隨著分子技術(shù)的發(fā)展，越來越多的控制水稻愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生的QTLs將被挖掘，進(jìn)而闡明水稻愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生的調(diào)控分子機(jī)制。在此基礎(chǔ)上，我們可以建立一個(gè)適用于秈稻的高效轉(zhuǎn)化體系和方法，從而為我國轉(zhuǎn)基因技術(shù)在水稻育種中應(yīng)用打下理論基礎(chǔ)。

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(本欄目責(zé)任編輯：周介雄)

Research Progress of Rice Callus Differentiation and Regeneration

ZHUKeming1,TAOHuimin1,XUShuo1,DUANLiqin2,YANGYanhua1

2016-06-10

國家自然科學(xué)基金委員會(huì)資助項(xiàng)目青年基金(編號(hào)：31201189)；江蘇大學(xué)高級(jí)專業(yè)人才科研啟動(dòng)基金(編號(hào)：10 JDG 134)和江蘇省高校自然科學(xué)研究項(xiàng)目(編號(hào)：12 KJB 210002)共同資助。

朱克明(1980—)，男，江蘇無錫人；博士，研究方向：水稻基因功能研究；E-mail：uegzkg@sina.com.cn。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2016.11.055

S 511

A

1001-4705(2016)11-0055-05