王忠琴（輝南縣輝發(fā)城鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，吉林通化135100）

固液相色譜法同時(shí)檢測(cè)畜禽糞便抗生素的方法

王忠琴
（輝南縣輝發(fā)城鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，吉林通化135100）

目的：使用固相萃取——高效液相色譜法檢測(cè)畜禽糞便中的抗生素殘留。方法：使用Na2EDTA-Mcllvaine緩沖液（pH=4.0）提取家禽糞便樣品，經(jīng)HLB固相萃取小柱純化富集，以及高效液相色譜分離檢測(cè)。結(jié)果：3信倍噪比下四環(huán)素、氟喹諾酮氨磺二甲嘧啶的檢出限分別為0.20～7.20μg/kg、0.16～3.15μg/kg、0.05μg/kg，三種抗生素豬糞的加標(biāo)回收率分別為60%～100%、41%～120%、94%～101%，雞糞的加標(biāo)回收率分別為70%～101%、65%～99%、115%～120%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差均在2.5%～9.3%之間。結(jié)論：固液相色譜法具較高的準(zhǔn)確度，可對(duì)禽糞便四環(huán)素、喹諾酮及磺胺二甲嘧啶類(lèi)抗生素同時(shí)檢出。

家禽糞便；固相萃?。桓咝б合嗌V

隨著社會(huì)的不斷發(fā)展，家禽養(yǎng)殖業(yè)也逐漸向現(xiàn)代化方向發(fā)展，規(guī)模化、集約化的養(yǎng)殖方式出現(xiàn)，使得抗生素家禽養(yǎng)殖中被廣泛應(yīng)用［1］。而抗生素在家禽體內(nèi)的吸收性差，約有 30% ～90%的抗生素會(huì)以原藥的形式隨著糞便從家禽體內(nèi)排除［2］，對(duì)土壤及地表水源造成污染。因此需要對(duì)家禽糞便中抗生素予以分析檢測(cè)，以減少抗生素對(duì)環(huán)境的污染。筆者本次主要分析固液相色譜法同時(shí)對(duì)檢測(cè)畜禽糞便抗生素的方法，內(nèi)容如下：

1　儀器與試劑

1.1儀器與試劑

HLB固相萃取柱、Visiprep TM-DL固相萃取裝置、WD-12氮吹儀、Agilent-1200高效液相色譜儀、ASE300加速溶劑萃取裝置；土霉素、四環(huán)素、金霉素、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、諾美沙星；甲醇、乙腈（色譜純）檸檬酸、EDTA鈉鹽、NaOH等試劑為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2溶液配制

稱取各類(lèi)所需抗生素1毫克分別裝入10毫升容量瓶中。使用甲醇溶解四環(huán)素類(lèi)、磺胺類(lèi)和大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素。

1.3樣品采集與處理

采集新鮮家禽糞便（選擇本地區(qū)規(guī)?；仪蒺B(yǎng)殖場(chǎng)）樣品冷凍干燥后，粉碎過(guò)篩，在家禽糞便樣品中加入抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)液，渦旋震蕩 1分鐘，常溫下超聲 20分鐘，4℃下 10000轉(zhuǎn) /分鐘離心 10分鐘，取上清液 10毫升，重復(fù)上述步驟 2次，分別取上清液 10毫升、5毫升，將三次提取上清液混合后，取 5毫升予以超純水稀釋（甲醇含量＜10%），過(guò)固相萃取小柱，依次使用5毫升甲醇和5毫升 0.2mol檸檬酸溶液火化，將以上提取物以5毫升/分鐘流速過(guò)柱，依次使用10毫升 5%甲醇溶液和10毫升水沖洗HLB小柱，用 10毫升二氯甲烷洗脫目標(biāo)抗生素，洗脫液在氮?dú)庀麓蹈芍?0.1毫升以下。加入 1μg內(nèi)標(biāo)物質(zhì) LOM，使用甲醇——水混合液定容至 1毫升，供HPLC-MS/NS檢定。

1.4色譜條件

采用InertsilODS-3色譜柱；流動(dòng)相為乙腈（A）和1%乙酸（B），流速為 0.8毫升 /分鐘；柱溫 30℃；梯度洗脫程序：0～18分鐘，10%A；18～20分鐘，37%，80%A。

2　結(jié)果

分別在各類(lèi)樣品中添加四環(huán)素類(lèi)、喹諾酮類(lèi)、硫胺二甲嘧啶類(lèi)抗生素 1μg/g、5μg/g、10μg/g三個(gè)含量水平，結(jié)果顯示豬糞的加標(biāo)回收率分別為 60%～100%、41%～120%、94%～101%，雞糞的加標(biāo)回收率分別為 70%～101%、65%～99%、115%～120%。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差均在2.5%～9.3%之間，說(shuō)明檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性和精密度高。

3　討論

由于家禽糞便樣品復(fù)雜，含有蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪和各種無(wú)機(jī)成分，因此在對(duì)樣品進(jìn)行選擇時(shí)要確保標(biāo)準(zhǔn)物的定量。而在凈化步驟中，對(duì)環(huán)境樣品中抗生素前處理，HLB為目前效果最佳的柱子［3］。在洗脫實(shí)驗(yàn)中選擇二氯甲烷作為洗脫機(jī)，主要是由于二氯甲烷對(duì)金霉素的洗脫率好，且洗脫下來(lái)的雜質(zhì)少，使色譜圖中的目標(biāo)分離物和檢測(cè)不受干擾。

抗生素是一種可離子化的極性有機(jī)化合物，因此流動(dòng)相的pH值對(duì)抗生素物質(zhì)的分離和檢測(cè)非常重要，一般選擇有機(jī)溶劑和緩沖液按照一定比例混合，最常見(jiàn)的有機(jī)溶劑為乙腈和甲醇，其對(duì)紫外線的吸收率低，緩沖液選擇乙酸，主要是乙酸作為流動(dòng)相的峰形好。過(guò)低的pH會(huì)降低色譜柱的使用范圍，一般緩沖液的pH值控制在2～3內(nèi)，流動(dòng)相選擇 1%乙酸（pH=2.6）。在檢測(cè)時(shí)選擇 270毫米作為檢測(cè)波長(zhǎng)，主要使用270毫米檢測(cè)波長(zhǎng)，對(duì)四環(huán)素、氟喹諾酮氨磺二甲嘧啶三種抗生素均具有較高的響應(yīng)值，且分布相對(duì)均勻。

綜上所述：固液相色譜法具較高的準(zhǔn)確度，可對(duì)禽糞便四環(huán)素、喹諾酮及磺胺二甲嘧啶類(lèi)抗生素同時(shí)檢出。

［1］李艷霞，李帷，張雪蓮，等.固相萃取4高效液相色譜法同時(shí)檢測(cè)畜禽糞便中 14種獸藥抗生素 ［J］.分析化學(xué)研究報(bào)告，2012，40（02）：213-217.

［2］王麗，鐘冬蓮，陳光才，等.固相萃取——高效液相色譜——串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定畜禽糞便中的殘留抗生素 ［J］.色譜，2013，31（10）：1010-1015.

［3］張敏，劉慶玉，敖永華.高效液相色譜——熒光檢測(cè)畜禽糞污中四種氟喹諾酮類(lèi)抗生素殘留［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，51 （03）：602-604.

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ADOI編號(hào)：10.14025/j.cnki.jlny.2016.17.026

王忠琴，大專學(xué)歷，輝南縣輝發(fā)城鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，獸醫(yī)師，研究方向：動(dòng)物檢疫。