張好強,余紅霞,唐　明

(西北農(nóng)林科技大學 林學院 陜西楊陵 712100)

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油松根際外生菌根真菌龜裂禿馬勃的分離鑒定及培養(yǎng)

張好強,余紅霞,唐明*

(西北農(nóng)林科技大學 林學院 陜西楊陵 712100)

摘要:該研究采用組織分離法對黃土高原子午嶺林區(qū)連家砭林場油松根際外生菌根真菌進行了分離,并采用ITS序列對分離的真菌進行鑒定,研究了菌根真菌的培養(yǎng)條件,為菌劑的生產(chǎn)奠定基礎。結(jié)果表明:子午嶺林區(qū)油松根際分離培養(yǎng)出的真菌為龜裂禿馬勃(Handkea utriformis),能夠與油松形成外生菌根。采用MMN培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基,純培養(yǎng)條件下,龜裂禿馬勃生長的最適pH為6.0,最適溫度為25 ℃。以蔗糖為唯一碳源的培養(yǎng)基中龜裂禿馬勃生長速度最快,其次是麥芽糖和葡萄糖,生長最慢的為乳糖,在以幾丁質(zhì)和碳酸氫鈉為碳源的培養(yǎng)基上不生長。有機氮源中,對脯氨酸為唯一氮源的利用能力最好,其次是酪蛋白,尿素最差;無機氮源中,以磷酸氫二銨為唯一氮源時生長最好,其次是硝酸鈣,最差為酒石酸銨。該研究首次報道了黃土高原子午嶺林區(qū)外生菌根真菌龜裂禿馬勃,并初步確定了其最佳培養(yǎng)條件。

關鍵詞:龜裂禿馬勃;外生菌根真菌;黃土高原子午嶺林區(qū);最佳培養(yǎng)條件

外生菌根(ectomycorrhiza,ECM)是林木最重要的菌根類型[1],廣泛分布于全球范圍內(nèi)多種林木樹種[2]。基于分類學和生態(tài)學的調(diào)查,2%～3%的陸生植物能夠與ECM真菌形成外生菌根[3-4],其中包括許多重要的生態(tài)和經(jīng)濟林木,如松科、殼斗科、樺木科、南青岡科、龍腦香科和蘇木科的林木[5]。ECM可以增加宿主植物根系的吸收面積,提高植物對土壤營養(yǎng)的吸收和利用,促進植物生長,改善植物在逆境條件下的適應性以及增強宿主植物的抗逆性,提高逆境條件下宿主植物的成活率[1,5]。

ECM真菌的分離和純化是室內(nèi)和野外研究ECM真菌的前提和基礎。不同ECM真菌生長的最適pH、溫度、碳源和氮源不盡相同[6-9]。由于ECM真菌與林木之間復雜的共生關系,其共生機理涉及到的代謝產(chǎn)物等很多方面都不明確,許多ECM真菌的分離培養(yǎng)比較困難。因此,探索ECM真菌的生物學特性、配制合適的培養(yǎng)基等就成為ECM真菌分離培養(yǎng)成功與否的關鍵[1]。

油松(Pinustabulaeformis)為中國暖溫帶森林主要建群種,在黃土高原子午嶺林區(qū)目前存在唯一保存較為完整的天然次生林,同時存在有超過53 000 hm2的人工純林[10]。油松對ECM有很強的依賴性并能夠與多種真菌形成共生關系[1,11-12],然而目前針對子午嶺林區(qū)油松根際ECM真菌的研究相對匱乏。本研究首次在子午嶺林區(qū)油松林采集真菌子實體進行分離、鑒定,并將所得真菌回接油松檢測能否成功定殖于油松根系,形成外生菌根。在此基礎上,純培養(yǎng)條件下研究ECM真菌生長的環(huán)境因子(溫度和pH),以及營養(yǎng)因子(碳源和氮源),確定適宜ECM真菌生長的最佳條件,為ECM真菌菌絲體的擴繁和菌劑生產(chǎn)奠定基礎。

1材料和方法

1.1野外真菌的采集與培養(yǎng)

1.1.1采樣地概述研究區(qū)位于甘肅省合水縣連家砭林場(108°10′～109°18′E,35°03′～36°37′N),坐落在黃土高原子午嶺林區(qū)北部。該地區(qū)為黃土高原丘陵溝壑區(qū),屬中溫帶半干旱大陸性季風氣候。海拔1 211～1 453 m,年均氣溫7.4 ℃,年均降雨量587.6 mm。近來年,人工林面積持續(xù)增加,其中油松人工林的覆蓋面積約為53 000 hm2,占人工林總面積的81%。最常見的伴生樹種為遼東櫟(Quercusliaotungensis)、山楊(Populusdavidiana)和虎榛子(Ostryopsisdavidiana)[13]。

1.1.2樣品采集及真菌分離2010年8月中下旬,在研究區(qū)利用路線調(diào)查和隨機踏查相結(jié)合的方法,在油松林下裸露油松根系,尋找大型真菌子實體,進行攝影、記錄特征,并小心沿著子實體上的菌索挖至根系,以初步確定是否為ECM真菌,然后小心采集子實體,做好標記,用吸水紙包好裝入冰盒帶回實驗室,48 h內(nèi)進行分離。用以提取DNA的子實體置于-20 ℃冰箱備用。

真菌分離采用組織分離法,將子實體表面消毒后,無菌操作取新鮮菌肉4 mm3置于培養(yǎng)基上,分離培養(yǎng)基為PDA和MMN[1],每1 000 mL培養(yǎng)基中加入3 mL乳酸和0.06 g鏈霉素。分離后將培養(yǎng)皿放入25 ℃恒溫箱中暗培養(yǎng)。

1.1.3真菌鑒定取純培養(yǎng)菌絲體、新鮮子實體和成熟風干子實體孢子粉進行ITS序列分析。真菌基因組DNA采用CTAB法提取[14]。真菌ITS序列使用ITS1-F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)進行PCR擴增[15]。PCR采用50 μL體系,其中包括0.5 μLTaq酶(5 U/μL),2 μL DNA模板,4 μL dNTP mixture (2.5 mmol/L),1 μL引物ITS1-F和ITS4 (10 μmol/L),5 μL 10倍PCR buffer (Mg2+free),4 μL Mg2+(25 mmol/L)和32.5 μL ddH2O。PCR條件為:94 ℃預變性3 min;35個循環(huán),95 ℃變性45 s,55 ℃退火55 s,72 ℃延伸45 s;最終72 ℃延伸10 min。取PCR產(chǎn)物5 μL,在1%瓊脂糖凝膠電泳(100 V,30 min)檢測。PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程公司進行雙向測序。

將獲得的ITS序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫后,在線運用BLAST工具進行同源比對,并從NCBI下載GenBank數(shù)據(jù)庫內(nèi)已知同源序列。使用序列構建軟件Clustal X 1.81和MEGA(Version 5.05)進行對比分析,用Neighbor-Joining法構建系統(tǒng)發(fā)育樹,Kimura-two-parameter模型計算遺傳距離,1 000次隨機抽樣,計算Bootstrap值以評估系統(tǒng)發(fā)育樹的置信度[16]。

1.2培養(yǎng)真菌回接油松

1.2.1接種真菌培養(yǎng)將分離和純化的菌株接種到MMN培養(yǎng)基上,25 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)暗培養(yǎng)14 d后,接種時用內(nèi)徑1 cm的打孔器沿菌落邊緣打菌餅。

1.2.2育苗油松種子(陜西省林業(yè)廳林業(yè)技術推廣總站提供)用10% H2O2消毒20 min,無菌水沖洗數(shù)次后45 ℃浸泡6～7 h。消毒種子轉(zhuǎn)移到鋪有滅菌紗布的托盤中,25 ℃培養(yǎng)箱中催芽,每天早晚用水沖洗1次,待種子發(fā)芽后播入孔穴盤(滅菌蛭石)育苗。4周后挑選長勢一致的油松苗移栽。

1.2.3接種油松栽培基質(zhì)為河沙、土和蛭石(2∶2∶1,V/V/V)混合物,高溫高壓蒸汽滅菌(121 ℃,0.1 Mpa)2 h,放置7 d后使用。將油松苗移栽至一次性紙杯(含120 g栽培基質(zhì))每杯1株,同時取ECM真菌的菌餅4個放置在幼苗根系周圍。

1.2.4培養(yǎng)將接種ECM真菌的幼苗放入人工氣候箱(RQH-250,上海精宏)中培養(yǎng),培養(yǎng)箱參數(shù)設置如下:14 h光照/d,25 ℃;無光照10 h/d,20 ℃;空氣濕度60%。

1.2.5檢測培養(yǎng)8周后,取油松根用流水洗掉表面土后,在體視顯微鏡下觀察根的形態(tài)、顏色,并拍照。將根剪成長約1 cm根段,染色后顯微鏡下觀察根內(nèi)及根外菌絲形態(tài)[5]。

1.3不同培養(yǎng)條件對ECM真菌生長的影響

1.3.1生長速度測定在MMN固體培養(yǎng)基上活化ECM真菌,用內(nèi)徑為0.5 cm的滅菌打孔器在菌落邊緣打取菌餅,接種到另一MMN培養(yǎng)基(直徑9.0 cm,20 mL/皿)中央,25 ℃恒溫暗培養(yǎng),每2 d用游標卡尺通過十字交叉法測量菌落直徑,連續(xù)記錄28 d。

1.3.2pH對生長的影響在250 mL的三角瓶中加入100 mL MMN液體培養(yǎng)基,用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH分別調(diào)整pH為3、4、5、6、7和8,然后在121 ℃、0.1 MPa條件下滅菌20 min。MMN液體培養(yǎng)基冷卻后接種1個0.5 mm直徑菌餅,25 ℃恒溫震蕩(120 r/min)培養(yǎng)14 d。菌絲用連接有布氏漏斗的真空泵抽濾獲得后80 ℃烘箱中烘至恒重,取出置于密閉干燥器中冷卻至室溫時稱菌絲干物重。每個處理設4個重復,試驗重復3次。

1.3.3溫度對生長的影響將1個0.5 mm直徑菌餅置于MMN培養(yǎng)基(直徑9.0 cm,20 mL/皿)中央,分別置于15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃和35 ℃下恒溫暗培養(yǎng),接種10 d后測量菌落直徑(方法同上)。每個處理設4個重復,試驗重復3次。

1.3.4碳源對生長的影響分別用10 g/L的葡萄糖、乳糖、甘露醇、可溶性淀粉、果糖、麥芽糖、蔗糖、幾丁質(zhì)(制備成膠體幾丁質(zhì)備用,方法參考Chen等[17])、海藻糖和碳酸氫鈉替代MMN培養(yǎng)基中的碳源物質(zhì)(葡萄糖+麥芽汁)。接種1個0.5 mm直徑菌餅后25 ℃恒溫暗培養(yǎng),接種10 d后測量菌落直徑(方法同上)。每個處理設4個重復,試驗重復3次。

1.3.5氮源對生長的影響分別用0.5 g/L的酒石酸銨、磷酸氫二胺、硝酸納、硝酸鈣、硝酸銨、硫酸銨、甘氨酸、脯氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、尿素和酪蛋白替代MMN培養(yǎng)基中的氮源物質(zhì)((NH4)2HPO4+麥芽汁)。接種1個0.5 mm直徑菌餅后25 ℃恒溫下暗培養(yǎng),接種10 d后測量菌落直徑(方法同上)。每個處理設4個重復,試驗重復3次。

1.4數(shù)據(jù)處理與分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2010整理,使用SAS(Version 8.1)軟件進行方差分析(ANOVA),使用Duncan新復極差法進行多重比較。

2結(jié)果與分析

2.1菌種分離與鑒定

野外采集的子實體呈陀螺形,褐色,寬8～10 cm,高10～12 cm(圖1)。從野外采集的子實體上成功分離的菌株在PDA及MMN培養(yǎng)基上生長良好,呈白色棉絮狀(圖2),其生長較為緩慢,且在培養(yǎng)過程中不產(chǎn)孢。

圖1　成熟子實體照片

圖2　分離菌株在MMN(A)和PDA(B)培養(yǎng)基上

對分離得到真菌的純培養(yǎng)菌絲體,以及新鮮子實體和成熟風干子實體孢子粉,使用ITS1-F和ITS4引物擴增后(約550 bp)進行雙向測序。結(jié)果表明野外采集的風干成熟子實體、新鮮子實體以及分離的菌株為同一真菌(菌株編號為H1)。NCBI的BLAST比對結(jié)果表明,H1(JN411549)與3株GenBank編號為DQ112607、EU833659和AJ617490的Handkeautriformis真菌序列相似度達99%;構建系統(tǒng)發(fā)育樹的分析結(jié)果表明(圖3),H1與這3株H.utriformis真菌的自展支持率為98%,因此可以將H1鑒定為H.utriformis(龜裂禿馬勃)。

2.2菌株回接油松

龜裂禿馬勃接種油松苗2個月后,能夠與油松苗根系形成ECM,主要形態(tài)為單軸狀和二叉分枝狀(圖4)。染色后顯微鏡觀察結(jié)果表明,龜裂禿馬勃與油松的ECM形成了菌套結(jié)構,出現(xiàn)在細根根端或者整個包圍細根,并在菌套四周有根外菌絲,根系內(nèi)形成許多根內(nèi)菌絲?？梢?龜裂禿馬勃能良好定殖于油松根系,形成外生菌根(圖4)。

2.3培養(yǎng)條件對龜裂禿馬勃生長的影響

2.3.1龜裂禿馬勃的生長曲線通過每天測量龜裂禿馬勃菌落直徑發(fā)現(xiàn),其生長緩慢,需要4周才能長滿整個平板(直徑9 cm)。龜裂禿馬勃在第2周和第3周時生長較快,而在第1周和第4周生長較為緩慢,生長曲線如圖5,A。

圖3　基于rDNA ITS序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹

A、B.外生菌根不同形態(tài);C～F.根段染色觀察:a.形成的菌根結(jié)構;b.根外菌絲;c.形成的菌套;d.根內(nèi)菌絲

2.3.2pH對龜裂禿馬勃生長的影響在pH 3.0～8.0的范圍內(nèi),龜裂禿馬勃均能生長,其生物量隨著pH升高先增加后降低,在pH 6.0時達到最大生物量,為(0.38±0.08) g(圖5,B)。pH 5.0和6.0時的生物量均高于pH 7.0,也高于pH 8.0,說明弱酸性環(huán)境更適合龜裂禿馬勃的生長,龜裂禿馬勃對酸性環(huán)境的適應力較堿性環(huán)境要好。然而,當pH下降至4.0和3.0,或上升到7.0和8.0時龜裂禿馬勃生物量顯著下降,說明龜裂禿馬勃對酸堿度的忍耐力有限,過酸和過堿的環(huán)境都不利于其生長。

2.3.3溫度對龜裂禿馬勃生長的影響溫度對龜裂禿馬勃生長影響顯著(圖5,C),并在25 ℃時生長最好;溫度升高后其生長顯著減弱,在35 ℃時生長最差;溫度下降至15 ℃和20 ℃時龜裂禿馬勃的生長也顯著減弱,但分別較溫度升高至30 ℃和35 ℃時的生長要好。因此,龜裂禿馬勃對溫度升高更為敏感,而對溫度降低的耐受性強于溫度升高。這可能與該真菌生活在野外森林環(huán)境中有關,森林中晚上溫度較白天溫度低,對真菌的生長和進化有一定的適應和選擇作用。

圖中不同小寫字母表示經(jīng)Duncan新復極差法

2.3.4碳源對龜裂禿馬勃生長的影響龜裂禿馬勃對不同碳源的利用能力不同。研究發(fā)現(xiàn),龜裂禿馬勃在以幾丁質(zhì)和碳酸氫鈉為碳源的培養(yǎng)基上不生長,故僅對剩余8種碳源進行分析,結(jié)果見圖6,A。以蔗糖為碳源的培養(yǎng)基中龜裂禿馬勃生長效果最好,直徑達到(4.65±0.15) cm,其次在麥芽糖和葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中也能較好生長,直徑分別為(4.52±0.29) cm和(4.49±0.10) cm;而其對其它5種碳源的利用能力顯著低于這3種碳源,其中以其對乳糖的利用能力最差,直徑僅(1.65±0.17) cm。因此,培養(yǎng)龜裂禿馬勃的最佳碳源是蔗糖。

C1.葡萄糖;C2.乳糖;C3.甘露醇;C4.可溶性淀粉;C5.果糖;

2.3.5氮源對龜裂禿馬勃生長的影響龜裂禿馬勃在本試驗14種氮源中均能生長,但其對不同氮源利用能力不同(圖6,B)。有機氮源中,對脯氨酸的利用能力最好,生長量達(5.66±0.10) cm,其次是酪蛋白,生長量為(5.07±0.24) cm,而在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基上生長最差,僅為(0.99±0.24) cm。無機氮源中,在以銨態(tài)氮磷酸氫二銨為唯一氮源時生長最好,生長量達(4.51±0.11) cm,其次是硝酸鈣,為(4.29±0.15) cm,最差為酒石酸銨,僅為(1.16±0.23) cm。龜裂禿馬勃在以不同氨基酸為氮源的培養(yǎng)基上生長差異明顯,其中脯氨酸有利于龜裂禿馬勃的生長,生長量達(5.66±0.10) cm,而對精氨酸的利用最差,僅為(1.29±0.09) cm。由此可知,龜裂禿馬勃對氨基酸具有一定的選擇性。

3討論

經(jīng)分子特征鑒定以及回接油松檢驗,本研究首次在子午嶺林區(qū)油松林分離得到油松外生菌根真菌——龜裂禿馬勃(Handkeautriformis)[18]。該菌的同物異名較多,現(xiàn)在比較普遍認可的是Calvatiabovista(Pers.) Kambly & Lee和Calvatiautriformis(Bull.:Pers.) Jaap,其次是LycoperdonutriformeBull.。Handkea屬自1989年從馬勃屬(Calvatia)獨立出來,在2008年《真菌詞典》第10版分類系統(tǒng)中Handkea在分類地位上屬于真菌界(Fungi)、擔子菌門(Basidiomycota)、傘菌綱(Agaricomycetes)、傘菌目(Agaricales)、馬勃科(Lycoperdaceae)。目前能檢索到的Handkea屬包括5個種,除了H.utriformis外,其余4個種分別為H.excipuliformis、H.fumosa、H.lycoperdoides和H.subcretacea。龜裂禿馬勃在南美、北美、新西蘭、歐洲等地區(qū)均有報道[19-21]。在黃土高原子午嶺林區(qū)油松形成外生菌根為首次發(fā)現(xiàn)。

龜裂禿馬勃的子實體不僅可以食用,同時還具有一定的藥用價值[22-23],為了更好地發(fā)揮其作用,本研究進一步研究了龜裂禿馬勃的培養(yǎng)條件。純培養(yǎng)條件下,龜裂禿馬勃生長的最佳pH 為6.0,最適溫度為25 ℃,最佳碳源和氮源分別為蔗糖和脯氨酸。一般來說,菌根真菌喜偏酸性環(huán)境,最適pH為4.0～6.0[1]。本研究中,龜裂禿馬勃符合這一特點。然而有些菌根真菌如黃地勺菌(Spathulariaflavida)和美麗褶孔牛肝菌(Phylloporusbellus)在微堿條件下生長較好[24]。不同外生菌根真菌生長的最適溫度不同,絕大多數(shù)為25 ℃[25],少數(shù)如暗褐網(wǎng)柄牛肝菌(Phlebopusportentosus)最佳培養(yǎng)溫度為30 ℃[8]。葡萄糖、麥芽糖和蔗糖被認為是影響真菌菌絲生長最重要的3種碳源[1]。Adour等[26]研究發(fā)現(xiàn),與無機氮如硝酸銨和硫酸銨相比,有機態(tài)氮(如賴氨酸等氨基酸)更能促使一些代謝產(chǎn)物的蓄積。但有報道認為,無機態(tài)氮可能更有利于真菌相關代謝酶類的表達和分泌[27]。本研究結(jié)果對龜裂禿馬勃的進一步研究和應用具有重要的指導意義。

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(編輯:潘新社)

Isolation,Identification and Cultivation of Ectomycorrhizal FungusHandkeautriformisin the Rhizosphere ofPinustabulaeformis

ZHANG Haoqiang,YU Hongxia,TANG Ming*

(College of Forestry,Northwest A&F University,Yangling,Shaanxi 712100,China)

Abstract:The ectomycorrhizal fungus from Ziwuling forest region on the Loess Plateau was isolated by tissue isolation technique,identified based on ITS sequence,and the cultivation condition in vitro was further investigated to establish the basis of inoculum production.Result showed the isolated fungus from Ziwuling forest region was Handkea utriformis,which could form ectomycorrhiza with Pinus tabulaeformis.Using MMN medium,the optimum pH was 6.0 and temperature was 25 ℃.Growth rate of H.utriformis on MMN medium with sucrose was the fastest,followed by maltose and glucose,and the slowest growth rate was for lactose.This fungus did not grow on medium using chitin and sodium bicarbonate as carbon source.For organic nitrogen source,H.utriformis grow fastest on MMN medium with proline,followed by casein,and slowest with urea.For inorganic nitrogen source,H.utriformis grow fastest with diammonium hydrogen phosphate,followed by calcium nitrate,and slowest with ammonium molybdate.For the first time,this study reported the ectomycorrhizal fungus H.utriformis in the Ziwuling region on the Loess Plateau,and its optimum growth condition in vitro was preliminary confirmed.

Key words:Handkea utriformis;ectomycorrhizal fungus;The Ziwuling forest region on the Loess Plateau;optimum growth condition

中圖分類號:Q93-331

文獻標志碼:A

作者簡介:張好強(1982-),男,講師,主要從事微生物學與森林保護學研究。E-mail:zhanghaoqiang@nwsuaf.edu.cn*通信作者:唐明,教授,博士生導師,主要從事微生物學與森林保護學研究。E-mail:tangm@nwsuaf.edu.cn

基金項目:林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(201404217);國家自然科學基金(31170567);西北農(nóng)林科技大學博士科研啟動基金(Z109021503)

收稿日期:2015-11-06;修改稿收到日期:2015-12-11

文章編號:1000-4025(2016)02-0419-07

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.02.0419