蘇 暢，宋 茜，邵鵬柱，黃家樂，魯 藝，王淑紅，王鐵杰＊＊

（1.深圳市藥品檢驗(yàn)研究院 深圳藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 深圳 518057；2.香港中文大學(xué)中醫(yī)中藥研究所 香港 999077；3.香港中文大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 香港 999077）

《中國(guó)藥典》中蘄蛇飲片分子鑒定方法的研究和探討＊

蘇 暢1，宋 茜1，邵鵬柱2，3，黃家樂2，魯 藝1，王淑紅1，王鐵杰1＊＊

（1.深圳市藥品檢驗(yàn)研究院 深圳藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 深圳 518057；2.香港中文大學(xué)中醫(yī)中藥研究所 香港 999077；3.香港中文大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 香港 999077）

目的：運(yùn)用多種分子鑒定方法，從技術(shù)要求和標(biāo)準(zhǔn)編寫方面對(duì)蘄蛇飲片現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提出建議。方法：本研究選取蘄蛇所在蝰科Viperidae蝮亞科Crotalinae的7個(gè)近緣物種和9種常見的蘄蛇偽品物種作為研究對(duì)象，采用DNA條形碼技術(shù)擴(kuò)增16S rRNA序列，運(yùn)用電泳檢視法，根據(jù)擴(kuò)增條帶的有無評(píng)價(jià)模板DNA的質(zhì)量；16S rRNA序列擴(kuò)增產(chǎn)物通過雙向測(cè)序，運(yùn)用BioEdit軟件拼接，雙端對(duì)齊后剪切比對(duì)，利用MEGA 5.1軟件構(gòu)建鄰接（NJ）系統(tǒng)發(fā)育樹；采用蘄蛇飲片現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行同步鑒別。結(jié)果：16S rRNA序列的電泳檢視結(jié)果可有效評(píng)價(jià)蘄蛇樣品的模板DNA質(zhì)量，避免由于模板DNA質(zhì)量不佳導(dǎo)致的假陰性結(jié)果的可能性；基于16S rRNA條形碼序列建立的NJ樹可以鑒別蘄蛇飲片及其混淆品；蘄蛇飲片現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)方法專屬性良好。結(jié)論：DNA條形碼方法、現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)方法以及NJ樹三者相互結(jié)合，從不同角度對(duì)蘄蛇飲片進(jìn)行真?zhèn)舞b別，有效彌補(bǔ)蘄蛇飲片現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)方法的不足，為其他中藥品種的分子鑒定技術(shù)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定提供了參考。

分子鑒定技術(shù) 蘄蛇飲片 中國(guó)藥典 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 16S rRNA

蘄蛇，又稱尖吻蝮蛇、五步蛇，是中國(guó)特有的蛇種。在動(dòng)物分類學(xué)領(lǐng)域，蘄蛇屬于蝰科Viperidae蝮亞科Crotalinae尖吻蝮屬Deinagkistrodon內(nèi)的唯一物種，其近緣物種為中國(guó)蝮亞科已知的6屬19種蛇[1]。從中藥學(xué)角度看，蘄蛇為一味傳統(tǒng)的動(dòng)物類中藥材，其藥用歷史悠久，臨床療效確切，主要用于治療皮膚疾患、風(fēng)濕頑痹、中風(fēng)痙攣及半身不遂等疾病?！吨袊?guó)藥典》收載的中藥蘄蛇為蝰蛇科動(dòng)物五步蛇Deinagkistrodon acutus（Guenther）的干燥體[2]，由于蘄蛇藥用資源有限，臨床用量較大，導(dǎo)致蘄蛇藥材和蘄蛇飲片的價(jià)格昂貴，不法分子趁機(jī)摻假制假，擾亂醫(yī)藥市場(chǎng)。目前市場(chǎng)上存在以其他種類的蛇冒充蘄蛇的現(xiàn)象，給蘄蛇飲片的質(zhì)量控制和藥品監(jiān)管帶來較大的困難，同時(shí)也為臨床患者用藥帶來安全隱患。

近年來，隨著分子生物學(xué)科的蓬勃發(fā)展，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（Polymerase Chain Reaction，PCR）在中藥鑒別領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[3,4]，在科研領(lǐng)域逐漸產(chǎn)生了RAPD、AFLP、ISSR、SNP、DNA barcoding等獨(dú)具特色的中藥分子鑒定技術(shù)[5-10]，極大地彌補(bǔ)了其他中藥鑒定技術(shù)的缺陷和不足?！吨袊?guó)藥典》2010年版首次收載蘄蛇飲片的PCR檢測(cè)方法，彌補(bǔ)了蘄蛇飲片在鑒別方法方面的缺失。此外《中國(guó)藥典》還陸續(xù)新增了川貝母藥材的PCRRFLP檢測(cè)方法以及“中藥材DNA條形碼分子鑒定法指導(dǎo)原則”，雖然這3種方法在原理上存在差異，但都可作為傳統(tǒng)的性狀鑒別方法和現(xiàn)代化學(xué)檢測(cè)方法的有效補(bǔ)充，現(xiàn)皆收載于《中國(guó)藥典》2015年版[2]。

然而，在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)層面，中藥分子鑒定技術(shù)尚屬起步階段，蘄蛇飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的PCR鑒別法依然存在一些問題，有待規(guī)范和完善。具體表現(xiàn)為以下3點(diǎn)：①缺少對(duì)模板DNA進(jìn)行質(zhì)量控制，無法避免由模板DNA質(zhì)量差引起的錯(cuò)判；②對(duì)摻偽品的鑒別存在局限性，無法有效地辨別樣品中的摻偽情況；③缺乏對(duì)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)書寫規(guī)范的要求，存在對(duì)模板DNA的配制過程中，描述過于詳細(xì)和缺少空白對(duì)照的問題，現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)有待進(jìn)一步規(guī)范和統(tǒng)一。本研究結(jié)合《中國(guó)藥典》收載的PCR法和DNA條形碼的特點(diǎn)，將不同的分子鑒定技術(shù)相互融合，對(duì)蘄蛇飲片現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行完善，并對(duì)中藥分子鑒定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)編寫方面提出建議，以期探討建立更加符合《中國(guó)藥典》要求的蘄蛇飲片分子鑒定方法的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為其他中藥品種的分子鑒定技術(shù)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所涉及的實(shí)驗(yàn)樣本共16份，其中完整的蘄蛇藥材樣本7份、蘄蛇藥材偽品6份，均購(gòu)自安徽省亳州中藥材交易中心、四川省成都市荷花池藥材市場(chǎng)和廣西省玉林中藥材市場(chǎng)；蘄蛇飲片偽品樣本2份，來源于深圳市藥品檢驗(yàn)所中藥標(biāo)本館；蘄蛇對(duì)照藥材1份，購(gòu)自中國(guó)食品藥品鑒定研究院（批號(hào)：121592-201201）。所有實(shí)驗(yàn)樣本經(jīng)深圳市藥品檢驗(yàn)所中藥室王淑紅主任中藥師鑒定，GenBank登錄號(hào)為KT313021-KT313027；另自GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)下載蘄蛇Deinagkistrodon acutus物種16S rRNA序列4條，圓斑蝰蛇Daboia russelii物種16S rRNA序列2條，白唇竹葉青蛇Trimeresurus albolabris和福建竹葉青蛇Tremeresurus stejnegeri物種16S rRNA序列各1條，菜花原矛頭蝮蛇Protobothrops jerdonii物種16S rRNA序列3條，原矛頭蝮蛇Protobothrops mucrosquamatus物 種 16S rRNA序列1條，山烙鐵頭蛇Ovophis monticola物種16S rRNA序列2條，中亞蝮蛇Gloydius halys和中介蝮 蛇 Gloydius intermedius物 種 16S rRNA序 列各1條，黑背白環(huán)蛇Lycodon ruhstrati和雙全白環(huán)蛇Lycodon fasciatus物種16S rRNA序列各1條，眼鏡王蛇Ophiophagus Hannah、銀環(huán)蛇Bungarus multicinctus和 舟 山 眼 鏡蛇Naja atra物 種16S rRNA序列各1條，眼鏡蛇Naja naja物種16S rRNA序列2條（材料信息詳見表1）。

1.2 DNA提取、PCR擴(kuò)增和測(cè)序

取樣品中肌肉組織約20 mg，采用血液組織細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒（Tiangen Biotech CO. China）提取基因組DNA，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用16S rRNA序列通用引物[11]（16L1和16H1）進(jìn)行模板DNA質(zhì)量的考察和DNA條形碼鑒別。PCR反應(yīng)體系總體積為25 μL，包括5×PCR緩沖液5 μL，dNTP 2 μL，引物（25 μmol·L-1）各0.3 μL，EX Taq DNA聚合酶（TAKARA）0.2 μL，模板DNA 2 μL。16S rRNA序列的反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性1 min，53℃退火1 min 30 s，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。

按照《中國(guó)藥典》2010年版中蘄蛇飲片PCR法規(guī)定的擴(kuò)增引物、反應(yīng)體系和條件進(jìn)行PCR鑒別。

取上述PCR產(chǎn)物2 μL，用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，GelRed染色，紫外凝膠分析成像檢測(cè)，剩余的PCR產(chǎn)物由上海立菲生物技術(shù)有限公司（廣州）采用雙向引物測(cè)序得到正、反方向的堿基序列。

1.3 數(shù)據(jù)分析

測(cè)序后的峰圖和序列使用BioEdit v7.0.4進(jìn)行拼接和校對(duì)，再將GenBank參考序列與市售樣品的測(cè)序序列經(jīng)兩端對(duì)齊后剪切比對(duì)；用MEGA 5.1軟件基于Kimura two parameter（K2P）模型計(jì)算遺傳距離，并采用鄰接法（Nerghbor-Joining，NJ）進(jìn)行物種鑒別，各分支的置信度自舉檢測(cè)（Bootstrap）1 000次。

2 結(jié)果及分析

2.1 16S rRNA序列通用引物擴(kuò)增結(jié)果

所有實(shí)驗(yàn)樣品運(yùn)用16S rRNA序列通用引物均可擴(kuò)增出DNA條帶（見圖1A），空白對(duì)照無條帶，擴(kuò)增成功率為100%，鑒定成功率100%。通過規(guī)定在400-500 bp分子量范圍內(nèi)，實(shí)驗(yàn)樣品的16S rRNA序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)顯單一的DNA條帶，即可有效地對(duì)模板DNA的提取質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)。

2.2 現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)結(jié)果

采用《中國(guó)藥典》蘄蛇飲片的PCR法對(duì)所有實(shí)驗(yàn)樣品進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果表明，蘄蛇對(duì)照藥材和蘄蛇藥材在相應(yīng)位置顯單一的DNA條帶，其余蘄蛇藥材偽品和蘄蛇飲片偽品均未顯DNA條帶，空白對(duì)照無條帶，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)鑒別方法的專屬性良好，可有效地對(duì)蘄蛇藥材和蘄蛇飲片的真?zhèn)芜M(jìn)行鑒別（見圖1B）。

表1 研究所用材料信息表

2.3 蘄蛇藥材16S rRNA序列長(zhǎng)度、GC含量、種內(nèi)序列變異及分析

16S rRNA序列的測(cè)序結(jié)果表明，7條市售蘄蛇樣品的16S rRNA序列堿基片段完全一致，GenBank登錄號(hào)為KT313021。與蘄蛇對(duì)照藥材和蘄蛇參考序列（EU729427）比較，堿基片段、序列長(zhǎng)度（406 bp）、GC含量（41.6%）也完全一致。

將7條市售蘄蛇樣品序列和GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的4條蘄蛇參考序列進(jìn)行序列分析，長(zhǎng)度均為406 bp，GC含量范圍為41.6%-42.1%，具有一定的種內(nèi)變異，存在11個(gè)突變位點(diǎn)，分別為第4、53、 123、254、295、367位點(diǎn)的C-T變異，第58、233、256位點(diǎn)的A-G變異，第124位點(diǎn)的A-C變異，第220位點(diǎn)的A-T變異。蘄蛇種內(nèi)平均K2P距離為0.014，種內(nèi)最大K2P距離為0.023，種內(nèi)最小K2P距離為0.005。

2.4 蘄蛇與其近緣物種和常見偽品16S rRNA序列長(zhǎng)度、種內(nèi)序列變異及分析

蘄蛇與其近緣物種和常見偽品序列進(jìn)行比對(duì)后的長(zhǎng)度為424 bp，種間變異較大，序列間存在較多的變異位點(diǎn)。蘄蛇與其近緣物種和常見偽品的種間平均K2P距離為0.102，種間最大K2P距離為0.163（眼鏡蛇Naja naja EU624270），種間最小K2P距離為0.051（山烙鐵頭Ovophis monticola HQ325091）。

本研究應(yīng)用16S rRNA片段序列對(duì)蘄蛇及其近緣物種和常見偽品進(jìn)行鑒別研究，發(fā)現(xiàn)各實(shí)驗(yàn)物種16S rRNA片段存在較大的堿基差異，同時(shí)蘄蛇的種內(nèi)最大K2P距離（0.023）小于種間最小K2P距離（0.051）。

2.5 蘄蛇近緣物種和常見偽品的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹鑒定

基于16S rRNA序列構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹（如圖2所示），蘄蛇樣品所在的尖吻蝮屬與其同科的竹葉青蛇屬、原矛頭蝮屬、烙鐵頭蛇屬、亞洲蝮屬物種聚為一支，說明彼此的親緣關(guān)系比較接近，而上述各屬物種又獨(dú)立成一小分支，從而表明蘄蛇樣品可以從近緣物種中有效地區(qū)分開來。同時(shí)，尖吻蝮屬物種與其同科的圓斑蝰屬以及游蛇科、眼鏡蛇科等9個(gè)常見偽品物種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，均可以相互區(qū)分。兩批蘄蛇飲片偽品在NJ樹中與游蛇科Euprepiophis mandarinus聚為一支。通過建立的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明蘄蛇與7個(gè)近緣物種和9個(gè)常見偽品均可以有效區(qū)分。

圖1 16S rRNA通用引物（A）和現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)鑒別引物（B）擴(kuò)增的凝膠鑒別圖

3 討論

目前《中國(guó)藥典》對(duì)薄層色譜法、高效液相色譜法等中藥鑒別技術(shù)形成的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)具有明確且統(tǒng)一的書寫規(guī)范和技術(shù)要求。但是分子鑒定技術(shù)剛進(jìn)入中藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)領(lǐng)域，以蘄蛇飲片為代表的中藥分子鑒別方法還存在一些問題有待完善和提高。

在技術(shù)要求方面，蘄蛇飲片現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)的鑒別方法應(yīng)增加對(duì)模板DNA的質(zhì)量控制。經(jīng)典的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)是采用紫外分光光度計(jì)，通過計(jì)算A260/ A280和A260/A230兩個(gè)比值對(duì)模板DNA的純度進(jìn)行評(píng)價(jià)。但由于中藥在經(jīng)過炮制加工后，模板DNA完整性較差，基質(zhì)也比較復(fù)雜，模板DNA的純度很難符合規(guī)定，因此，應(yīng)制定一種符合中藥特點(diǎn)的模板DNA質(zhì)量控制方法。本研究在蘄蛇飲片原標(biāo)準(zhǔn)的PCR鑒別反應(yīng)基礎(chǔ)上，增加16S rRNA通用引物的PCR擴(kuò)增反應(yīng)來評(píng)價(jià)模板DNA質(zhì)量，若實(shí)驗(yàn)樣品的通用引物擴(kuò)增無條帶，則表明模板DNA的濃度和純度較差，不適宜進(jìn)行PCR擴(kuò)增。通用引物PCR反應(yīng)可以有效避免由于模板DNA質(zhì)量不佳導(dǎo)致的假陰性結(jié)果的可能性。同時(shí)采用16S rRNA通用引物擴(kuò)增得到的PCR反應(yīng)產(chǎn)物，可進(jìn)行DNA條形碼的堿基序列分析，通過網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)，達(dá)到基原物種鑒別的目的。以單基原的樣本為例，若PCR鑒別結(jié)果為陽(yáng)性，同時(shí)DNA條形碼堿基序列出現(xiàn)混亂的套峰現(xiàn)象，會(huì)提示檢驗(yàn)人員樣品可能存在摻偽情況。

中醫(yī)藥的傳統(tǒng)理論強(qiáng)調(diào)宏觀的整體觀念和模糊性，忽略細(xì)微的個(gè)體差異。在分子生物學(xué)技術(shù)中，系統(tǒng)發(fā)育樹的建立與中藥指紋圖譜技術(shù)有著相似之處，二者都是通過數(shù)學(xué)模型計(jì)算比較各樣品間的差異，進(jìn)行相應(yīng)的模式識(shí)別和類群分析。參照中藥指紋圖譜的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)鑒別模式，將蘄蛇的近緣物種和常見偽品物種的DNA條形碼序列作為標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行匯總，利用規(guī)定的數(shù)學(xué)模型，通過系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建可對(duì)實(shí)驗(yàn)樣品進(jìn)行個(gè)體與類群的相關(guān)性分析，從而得出鑒定結(jié)果。本研究利用通用引物和鑒別引物分別進(jìn)行兩個(gè)PCR反應(yīng)，將DNA條形碼的擴(kuò)增結(jié)果和測(cè)序結(jié)果、現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)收載的PCR法擴(kuò)增結(jié)果以及系統(tǒng)發(fā)育樹的分類結(jié)果三者相結(jié)合，就可以從多個(gè)角度對(duì)蘄蛇飲片樣品進(jìn)行真?zhèn)舞b別，有效彌補(bǔ)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)鑒別方法的不足。

在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)書寫規(guī)范方面，蘄蛇飲片尚存在一些問題有待解決。首先，模板DNA的配制過程描述過于詳細(xì)，若嚴(yán)格按照藥典規(guī)定的步驟操作，不利于藥檢機(jī)構(gòu)檢驗(yàn)人員的具體實(shí)施，建議進(jìn)一步規(guī)范模板DNA制備的文字描述；其次，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)的鑒別方法缺少空白對(duì)照組，建議與川貝母標(biāo)準(zhǔn)中的相關(guān)描述統(tǒng)一。同時(shí)，為確保《中國(guó)藥典》的嚴(yán)謹(jǐn)性，還應(yīng)盡快制定中藥分子生物學(xué)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)起草和復(fù)核以及標(biāo)準(zhǔn)書寫的技術(shù)規(guī)范。

圖2 基于16S rRNA序列構(gòu)建的蘄蛇與其近緣物種和常見偽品的NJ樹

1 趙爾宓.中國(guó)蛇類.合肥:安徽科學(xué)技術(shù)出版社, 2005∶ 118-119.

2 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社, 2015∶372.

3 黃璐琦,唐仕歡,李軍德,等.動(dòng)物藥材分子鑒定研究策略.中國(guó)中藥雜志, 2011, 36(2)∶ 234-236.

4 陳士林,龐曉慧,姚輝,等.中藥DNA條形碼鑒定體系及研究方向.世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化, 2011, 13(5)∶ 747-754.

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6 Hebert P D, Stoeckle M Y, Zemlak T S, et al. Identification of birds through DNA barcodes. PLoS Biol, 2004, 2(10)∶ e312.

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8 Naik P K, Alam M A, Singh H, et al. Assessment of genetic diversity through RAPD, ISSR and AFLP markers in Podophyllum hexandrum: a medicinal herb from the Northwestern Himalayan region. Physiol Mol Biol Plants, 2010, 16(2)∶ 135-148.

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Study and Discussion on Molecular Identification of Agkistrodon Acutus Medicinal Slices in Chinese Pharmacopoeia

Su Chang1, Song Qian1, Shaw Pangchui2, 3, Wong Kalok2, Lu Yi1, Wang Shuhong1, Wang Tiejie1
(1. Shenzhen Institute for Drug Control, Shenzhen Key Laboratory of Drug Quality Standard Research, Shenzhen 518057, China; 2. Institute of Chinese Medicine, The Chinese University of Hong Kong, Hong Kong, China; 3. School of Life Sciences, The Chinese University of Hong Kong, Hong Kong, China)

The study aimed to establish a quality criteria specification for DNA molecular identification of Agkistrodon Acutus medicinal slices through combined use of different molecular identification technologies. Seven relative species in Deinagkistrodon and nine adulterants of Agkistrodon Acutus medicinal slices were selected as test materials. Gel electrophoresis inspection based on DNA barcoding was used to evaluate the quality of template DNA. The 16S rRNA regions were amplified and sequenced bi-directionally. Sequences that obtained were assembled and aligned by BioEdit. Molecular evolutionary analyses were conducted using MEGA 5.1 to build Neighbor-joining (NJ) phylogenetic tree. Meanwhile, the official identification method was also used in this study. As a result, the quality of template DNA can be evaluated by the results of gel electrophoresis inspection based on DNA barcoding. However, the official identification method was highly specific, which still cannot avoid the misjudgment of false negative. The NJ trees showed that Agkistrodon Acutus can be easily distinguished from its adulterants. Through the combined use of DNA barcoding, official identification method and NJ phylogenetic tree, Agkistrodon Acutus medicinal slices can be accurately identified. Our work also provides an example for accurate molecular identification of quality control.

Molecular identification, Agkistrodon acutus medicinal slices, Chinese Pharmacopoeia, quality control, 16S rRNA

10.11842/wst.2016.02.009

R282.5

A

（責(zé)任編輯：馬雅靜 張志華，責(zé)任譯審：朱黎婷 王 晶）

2015-11-29

修回日期：2015-12-07

＊ 深圳市科技創(chuàng)新委員會(huì)科技計(jì)劃項(xiàng)目（CXZZ20150529151451703）：中藥飲片染色摻偽快速檢測(cè)技術(shù)研發(fā)，負(fù)責(zé)人：魯藝。

＊＊ 通訊作者：王鐵杰，主任藥師，主要研究方向：藥品質(zhì)量控制、中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)、藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。