孫 鵬，李 倩，朱德豪，魏 盛

（山東中醫(yī)藥大學(xué) 腦行為分析實(shí)驗(yàn)室 濟(jì)南 250355）

兩種PMS肝氣逆證大鼠模型造模方法的效果比對(duì)分析＊

孫 鵬，李 倩，朱德豪，魏 盛＊＊

（山東中醫(yī)藥大學(xué) 腦行為分析實(shí)驗(yàn)室 濟(jì)南 250355）

目的：本文主要研究PMS肝氣逆證標(biāo)準(zhǔn)化大鼠模型的造模方法。方法：分別采用情志刺激為主擇時(shí)分段刺激造模法和情志刺激為主連續(xù)刺激造模法，制備PMS肝氣逆證大鼠模型，選擇氟西汀分散片和白香丹膠囊進(jìn)行藥物干預(yù)。通過(guò)對(duì)2種造模方法所得關(guān)鍵行為學(xué)指標(biāo)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析，篩選出最佳造模條件。結(jié)果：①擇時(shí)分段刺激造模法可以誘導(dǎo)大鼠的焦慮樣行為，并且在非接受期減弱、接受期加強(qiáng)，大鼠的各行為學(xué)指標(biāo)間發(fā)生明顯的同步改變，給予臨床PMS肝氣逆證有效藥物能夠改善這一現(xiàn)象；與正常組相比，造模組的各項(xiàng)行為學(xué)指標(biāo)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。②連續(xù)刺激造模法也可誘導(dǎo)大鼠的焦慮樣行為，但給予藥物干預(yù)后沒(méi)有改 善；在各項(xiàng)焦慮樣行為指標(biāo)中，僅進(jìn)入開(kāi)放臂時(shí)間百分比在接受期和非接受期存在明顯變化；雖然與接受期相比，模型組大鼠非接受期進(jìn)入開(kāi)放臂次數(shù)和百分比下降、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)總分提高，但其結(jié)果沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論：情志刺激為主的擇時(shí)分段刺激造模法，誘導(dǎo)出的PMS肝氣逆證大鼠模型，更為契合PMS肝氣逆證患者臨床表現(xiàn)。

PMS 肝氣逆證 動(dòng)物模型 造模方法

經(jīng)前期綜合征（Premenstrual Syndrome，PMS）是一組周期性出現(xiàn)在月經(jīng)周期黃體期的身體、精神和行為3方面的癥候群，并影響婦女的日常生活和工作，其中，肝氣逆證是PMS的主證之一[1,2]。近年來(lái)，PMS發(fā)病率逐漸增高，日益受到國(guó)內(nèi)外醫(yī)學(xué)界的關(guān)注。課題組前期研制的情志刺激為主多因素連續(xù)造模法[3,4]制備的PMS肝氣逆證大鼠模型，已被界內(nèi)普遍認(rèn)可和廣泛采用。但是該方法，在大鼠的非接受期（即人的月經(jīng)周期黃體期）仍進(jìn)行造模應(yīng)激刺激，顯然在病理病機(jī)上與臨床病患不符[5]。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇情志刺激為主多因素?fù)駮r(shí)分段刺激造模法制備PMS肝氣逆證大鼠模型，并比對(duì)分析課題組前期的連續(xù)刺激造模法，以實(shí)現(xiàn)PMS肝氣逆證大鼠模型造模方法的標(biāo)準(zhǔn)化，為PMS的研究提供更為準(zhǔn)確的病癥結(jié)合動(dòng)物模型。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雌性Wistar大鼠，健康未孕，體質(zhì)量160-180 g。北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2007-0001。

1.2 主要藥品

無(wú)水乙醇（天津市富宇精細(xì)化工有限公司，批號(hào)：XK1301100015）；生理鹽水（辰欣藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：1404132143）；氟西汀分散片（禮來(lái)蘇州制藥有限公司，批號(hào)：H20050463）；白香丹膠囊（青島海川創(chuàng)新生物天然藥物研究中心，批號(hào)：20071020）。

1.3 主要儀器

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱（山東中醫(yī)藥大學(xué)腦行為分析實(shí)驗(yàn)室自制）；高架十字迷宮（山東中醫(yī)藥大學(xué)腦行為分析實(shí)驗(yàn)室自制）；ST-A數(shù)字脈沖生物刺激儀（濟(jì)南空軍后勤裝配總廠、山東中醫(yī)藥大學(xué)聯(lián)合研制）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 篩選動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始之前，適應(yīng)性飼養(yǎng)大鼠7天，條件：晝夜顛倒環(huán)境（20∶00開(kāi)燈，08∶00關(guān)燈）、恒溫（23±3℃）、恒濕（60±5%RH）。選擇簡(jiǎn)易陰道涂片鏡檢法[6]：連續(xù)8天陰道涂片、1次/天，篩選出40只動(dòng)情周期規(guī)律 的大鼠進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。然后適應(yīng)性飼養(yǎng)8天（飼養(yǎng)條件同上），并參照Rygula R.等[7]研究，每日抓握全部大鼠，時(shí)間控制在5 min以上。暗淡燈光（＜28 lx）下進(jìn)行所有實(shí)驗(yàn)操作[8]。

2.2 動(dòng)物分組

適應(yīng)性飼養(yǎng)后，即實(shí)驗(yàn)第9日，對(duì)動(dòng)情周期規(guī)律的40只大鼠，進(jìn)行糖水偏好實(shí)驗(yàn)（Sucrose Preference Test，SPT）、曠場(chǎng)行為學(xué)（Open Field Test，OFT）、高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)（Elevated Plusmaze Test，EPM），采集相關(guān)數(shù)據(jù)，并隨機(jī)分為以下4組：正常對(duì)照組（Control）、PMS肝氣逆證模型組（Model）、氟西汀干預(yù)組（FXT）、白香丹干預(yù)組（BXD）。

2.3 動(dòng)物模型制 備

2.3.1 連續(xù)刺激造模法（實(shí)驗(yàn)Ⅰ）

根據(jù)本課題組前期研究結(jié)果[3]，對(duì)第一批次擬造模大鼠，從實(shí)驗(yàn)第13日起，行連續(xù)5天的情志刺激為主多因素造模法。具體操作：將模型組、氟西汀組和白香丹組大鼠，置于ST-A數(shù)字脈沖生物刺激儀內(nèi)，調(diào)整刺激條件：中等強(qiáng)度電流0.5 mA、電壓2 700-3 300 V、脈寬0.3 s、白天2檔（間隔時(shí)間5 min）、夜間3檔（間隔時(shí)間10 min）。

2.3.2 擇時(shí)分段刺激造模法（實(shí)驗(yàn)Ⅱ）

結(jié)合連續(xù)刺激造模法，僅在兩個(gè)動(dòng)情周期的非接受期刺激大鼠，改進(jìn)操作如下：對(duì)第二批次擬造模大鼠，從實(shí)驗(yàn)第13日起，行連續(xù)2天的造模刺激，接著暫停一日，然后繼續(xù)行連續(xù)2天的造模刺激。余造模條件同上。

2.4 給藥劑量和方法

各組大鼠于每日09∶00，按1 mL/100 g同時(shí)灌胃給藥，1次/日。正常組與模型組，給予等量純水。造模刺激同時(shí)，氟西汀組大鼠采用2.7 mg·kg-1·d-1氟西汀分散片灌胃干預(yù)；白香丹組大鼠給予200 mg·kg-1·d-1白香丹膠囊灌胃治療[9]。實(shí)驗(yàn)Ⅱ中，在造模第15日（即非造模刺激時(shí)），予氟西汀組和白香丹組大鼠以等量純水灌胃。

2.5 行為學(xué)數(shù)據(jù)的采集與測(cè)定

分別于實(shí)驗(yàn)第9日、第10日（即造模開(kāi)始前2天）07∶00采集大鼠相關(guān)行為學(xué)數(shù)據(jù)，作為接受期基線（R1）、非接受期基線（NR1）；于實(shí)驗(yàn)第18日、第19日（即造模結(jié)束后兩天）07∶00采集大鼠相關(guān)行為學(xué)數(shù)據(jù)，作為造模后的接受期數(shù)據(jù)（R2）、非接受期數(shù)據(jù)（NR2）[10]。具體如下：

2.5.1 糖水偏好實(shí)驗(yàn)（大鼠興趣偏好缺失度考察）

參照 Pandey D.K.等研究[11]，本實(shí)驗(yàn)的糖水偏好實(shí)驗(yàn)，予以大鼠1 h內(nèi)純水、0.8%蔗糖水溶液自由選擇，并半小時(shí)置換瓶子位置一次，以避免大鼠偏飲一側(cè)水。糖水偏好系數(shù)（Sucrose Consumption，SC）：SC%=糖水消耗/（糖水消耗+純水消耗）× 100%[10]。

2.5.2 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)（大鼠運(yùn)動(dòng)與探究行為[12]）

將大鼠置于曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱最中央的方格中，3位觀測(cè)者同時(shí)記錄大鼠3 min內(nèi)的直立次數(shù)和穿越底面方格次數(shù)，前者記為垂直得分（以大鼠兩前爪騰空或攀附墻壁為準(zhǔn)），后者記為水平得分（以大鼠四爪均進(jìn)入方格為準(zhǔn)），曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)總得分=垂直得分+水平得分[13]。得出各組得分情況后，盲法進(jìn)行行為學(xué)評(píng)定。

2.5.3 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)（大鼠焦慮程度考察[14]）

將大鼠置于高架十字迷宮中央平臺(tái)，3位觀測(cè)者同時(shí)記錄5 min內(nèi)大鼠的如下行為學(xué)指標(biāo)[15]：①進(jìn)入開(kāi)放臂次數(shù)（Open Arm Entry，OE）：大鼠肩部以上進(jìn)入開(kāi)放臂的次數(shù)；②進(jìn)入封閉臂次數(shù)（Close Arm Entry，CE）：大鼠肩部以上進(jìn)人封閉臂的次數(shù)；③進(jìn)入開(kāi)放臂時(shí)間（Open Arm Time，OT）：大鼠肩部以上進(jìn)入開(kāi)放臂的時(shí)間；④進(jìn)入封閉臂時(shí)間（Close Arm Time，CT）：大鼠肩部以上進(jìn)入封閉臂的時(shí)間，并由以上指標(biāo)分別計(jì)算出：⑤大鼠進(jìn)入開(kāi)放臂和封閉臂的總次數(shù)（Locomotor Activity in EPM，LA in EPM=OE+CE）；⑥進(jìn)入開(kāi)放臂次數(shù)百分比[OE%=OE/（OE+CE）×100%]；⑦開(kāi)放臂停留時(shí)間百分比[OT%=OT/（OT+CT）×100%][16]。采用盲法進(jìn)行行為評(píng)定。

2.6 行為學(xué)指標(biāo)的篩選

結(jié)合課題組前期經(jīng)驗(yàn)，選擇OFT、SPT、EPM實(shí)驗(yàn)中穩(wěn)定性較高、復(fù)測(cè)信度良好的行為學(xué)指標(biāo)納入統(tǒng)計(jì),具體指標(biāo)：糖水偏好系數(shù)（SC%）、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)總分（LA）、進(jìn)入開(kāi)放臂次數(shù)百分比(OE%)、開(kāi)放臂停留時(shí)間百分比（OT%）[17,18]。

2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

選用GraphPad Prism 6.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用單因素方差分析法,對(duì)造模后接受期與非接受期的行為學(xué)指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，組間比較用Bonferroni校正t檢驗(yàn)，顯著差異水平設(shè)定為P＜0.05。

3 結(jié)果

3.1 連續(xù)刺激造模后大鼠接受期及非接受期關(guān)鍵行為學(xué)指標(biāo)結(jié)果

如圖1所示，連續(xù)刺激造模后：①接受期：與模型組相比，氟西汀組大鼠SC%明顯升高（P＜0.05）；與正常組相比，模型組、氟西汀組大鼠LA明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組相比，白香丹組大鼠OT%明顯下降（P＜0.05）；②非接受期：與模型組相比，白香丹組大鼠SC%明顯上升（P＜0.05）；與正常組相比，模型組、氟西汀組大鼠LA明顯升高（P＜0.01，P＜0.01）；與模型組相比，白香丹組大鼠LA明顯下降（P＜0.05）。余參數(shù)接受期與非接受期均未見(jiàn)顯著性差異（P＞0.05）。

3.2 擇時(shí)分段刺激造模后大鼠接受期與非接受期關(guān)鍵行為學(xué)指標(biāo)結(jié)果

如圖2所示，擇時(shí)分段造模刺激后：①接受期：各組大鼠間，均不存在明顯差異；②非接受期：與正常組相比，模型組大鼠SC%、OT%、OE%明顯下降（P＜0.01，P＜0.05，P＜0.05）、LA明顯上升（P＜0.001）；與模型組相比，氟西汀組大鼠SC%、OT%、OE%明顯上升（P＜0.001，P＜0.05，P＜0.01）、LA明顯下降（P＜0.001）；與模型組相比，白香丹組大鼠SC%、OT%、OE%明顯上升（P＜0.001，P＜0.001，P＜0.01），LA則明顯下降（P＜0.01），但仍顯著高于正常組（P＜0.05）。

圖2 擇時(shí)分段刺激造模后大鼠接受期與非接受期關(guān)鍵行為學(xué)指標(biāo)比較

4 討論

王俊仁[19]研究發(fā)現(xiàn)：在不同的動(dòng)情周期刺激大鼠，會(huì)產(chǎn)生不同效果。課題組前期在PMS肝氣逆/郁兩證獼猴模型制備的探索中，也發(fā)現(xiàn)于雌性獼猴的黃體中晚期（相當(dāng)于人經(jīng)前期）進(jìn)行擠壓造模刺激，可誘導(dǎo)獼猴出現(xiàn)與PMS臨床患者典型癥狀相類似的行為表現(xiàn)[20]。綜上分析，我們初步推論：僅在大鼠連續(xù)2個(gè)動(dòng)情周期的非接受期進(jìn)行造模刺激，大鼠可能出現(xiàn)PMS樣情緒改變。

前期臨床流行病學(xué)調(diào)查中，課題組已提出PMS肝氣逆證的初步診斷標(biāo)準(zhǔn)為：主證：急躁易怒、頭目眩暈、頭脹痛，兩脅竄痛、胃脘脹痛；次證：失眠多夢(mèng)、吞酸噯氣、腸鳴腹瀉、月經(jīng)先期、脈弦、表情亢奮。主證“急躁易怒”為必備證狀，兼有其他任何一項(xiàng)及以上次證者診斷為肝氣逆證[21]。針對(duì)臨床PMS肝氣逆證患者上述癥狀表現(xiàn)，本課題組采用SPT-OFT-EPM多種行為學(xué)方法，對(duì)動(dòng)物模型進(jìn)行評(píng)價(jià)。糖水偏好實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：①擇時(shí)分段刺激造模法在非接受期，模型組大鼠SC%水平明顯下降，予以藥物干預(yù)后，SC%水平有所上升，與臨床PMS患者抑郁樣表現(xiàn)類似；②采用連續(xù)刺激造模法雖出現(xiàn)上述變化，但不存在顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。由此可見(jiàn)，擇時(shí)分段刺激造模法，能夠誘導(dǎo)PMS肝氣逆證大鼠快感缺失樣行為表現(xiàn)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中這一表現(xiàn)往往是和焦慮樣行為伴隨產(chǎn)生的。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，擇時(shí)分段刺激造模法顯示，模型組大鼠在關(guān)鍵行為學(xué)指標(biāo)LA上增加極為明顯；連續(xù)刺激造模法顯示模型組大鼠在該指標(biāo)上明顯增加。這提示擇時(shí)分段刺激造模法，對(duì)大鼠整體興奮性、敏感性的影響較連續(xù)刺激造模法更為明顯，行為表征上更為契合PMS臨床病患焦慮亢奮特征。高架十字迷宮結(jié)果發(fā)現(xiàn)，擇時(shí)分段刺激造模法顯示模型組大鼠OT%、OE%明顯降低，予以白香丹或氟西汀干預(yù)后，OT%、OE%均明顯升高；連續(xù)刺激造模法顯示，模型組和正常組大鼠OT%、OE%均低，且不存在顯著性差異。相比較而言，擇時(shí)分段刺激造模法各組大鼠在OT%、OE%等指標(biāo)上存在更為顯著的差異，證實(shí)該方法可成功誘導(dǎo)大鼠焦慮樣行為，這一行為的意義與臨床患者出現(xiàn)的急躁易怒情緒行為是等同的。

綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，再次證實(shí)我們上面的推論：僅在大鼠連續(xù)兩個(gè)動(dòng)情周期的非接受期進(jìn)行造模刺激，制備的PMS肝氣逆證大鼠模型，大鼠的行為學(xué)表現(xiàn)，更類似于臨床患者中出現(xiàn)的性情急躁易怒、緊張亢奮、焦慮等癥狀。

同時(shí)，我們還發(fā)現(xiàn)，擇時(shí)分段刺激造模法可以誘導(dǎo)大鼠焦慮樣行為的出現(xiàn)，并且在非接受期減弱、接受期增強(qiáng)，大鼠各行為學(xué)指標(biāo)間發(fā)生同步改變，臨床PMS肝氣逆證有效藥物能夠改善這一現(xiàn)象；相比于正常組，模型組的各項(xiàng)行為學(xué)指標(biāo)具有明顯差異。連續(xù)刺激造模法同樣可以誘導(dǎo)上述現(xiàn)象的出現(xiàn)，但不能被藥物所糾正；焦慮樣行為指標(biāo)中，僅OT%在接受期和非接受期存在明顯變化；雖然與接受期相比，模型組大鼠非接受期OE%下降、LA上升，但其結(jié)果不存在顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

綜上所述，擇時(shí)分段刺激造模法制備的PMS肝氣逆證大鼠模型，其類臨床癥狀的一組行為學(xué)指標(biāo)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異明顯；而連續(xù)刺激造模法制備的模型，只有一部分行為指標(biāo)有輕微變化，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，制備PMS肝氣逆證大鼠模型，較之擇時(shí)分段刺激造模法，情志刺激為主擇時(shí)分段刺激造模法所誘導(dǎo)的模型，與PMS肝氣逆證患者臨床表現(xiàn)更為契合。

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Comparing and Analyzing Effects of Two Modeling Methods on PMS Liver-Qi Invasion Rat Model

Sun Peng, Li Qian, Zhu Dehao, Wei Sheng
(Laboratory of Behavioral Brain Analysis, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China)

This study was designed to compare effects of two modeling methods in order to explore a standardized modeling method for premenstrual syndrome (PMS) liver-qi invasion syndrome. Based on the model replication methods, timing stimulation of emotional distress combining with multivariate segmentation method and continuous stimulation of emotional distress combining with multivariate segmentation method were selected to establish PMS liver-qi invasion rat models. Model rats were treated with Baixiangdan capsules and fluoxetine tablets. As a result, firstly, an optimal modeling method would be chosen by means of comparing and analyzing main behavioral indexes of the two modeling methods. It was found that anxiety-like behavior of rats was occurred through timing stimulation modeling method, which was enhanced in the non-acceptance period and was attenuated in the acceptance period in accordance with various behavioral indexes changes. These phenomena were corrected effectively by drug administration of clinical PMS liver-qi invasion syndrome. Compared with the normal group, behavior indexes of model group presented significant differences. Secondly, continuous stimulation modeling method also led to anxiety-like behavior in rats. However, the anxiety-like behavior indexes did not recovered after drug administration of clinical PMS liver-qi invasion syndrome. Among all behavior indexes, only percentage of open arm time changed significantly both in acceptance and non-acceptance period. Compared with acceptance period, though model rats showed lower open arm entry frequency and percentage scores in the non-acceptance period, and a higher score of locomotor activity in open field test, there did not show significant differences of behavior indexes between the two periods. It was concluded that timing stimulation of emotional distress combining with multivariate segmentation method induced PMS liver-qi invasion rat model successfully, which was in close relation to clinical syndrome.

Premenstrual syndrome, liver-qi invasion, animal model, modeling method

10.11842/wst.2016.02.002

R749

A

（責(zé)任編輯：朱黎婷 張志華，責(zé)任譯審：朱黎婷 王 晶）

2015-09-28

修回日期：2015-12-28

＊ 國(guó)家自然科學(xué)基金委面上項(xiàng)目（81573854）：經(jīng)前煩躁障礙（PMDD）肝氣逆/郁病證大鼠模型鑒定與標(biāo)準(zhǔn)化，負(fù)責(zé)人：?jiǎn)堂麋?；?guó)家自然科學(xué)基金委青年基金（81202617）：母鼠孕前肝疏泄失常對(duì)雄性子代行為及神經(jīng)生化的影響，負(fù)責(zé)人：魏盛。

＊＊ 通訊作者：魏盛，博士，講師，主要研究方向：情志病證動(dòng)物模型構(gòu)建平臺(tái)技術(shù)及情志致病機(jī)理。