樸麗梅　李玉子

(延邊大學(xué)附屬醫(yī)院,吉林　延吉　133000)

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內(nèi)皮型一氧化氮合酶基因G894T多態(tài)性與延邊地區(qū)冠心病的相關(guān)性

樸麗梅李玉子

(延邊大學(xué)附屬醫(yī)院,吉林延吉133000)

摘要〔〕目的探討內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因G894T多態(tài)性與中國延邊地區(qū)老年冠心病(CHD)的相關(guān)性。方法將研究對象分為正常對照組、CHD組、心肌梗死(MI)亞組，并根據(jù)病變累及冠脈血管支數(shù)分為單支、雙支和多支病變組。采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外擴(kuò)增目的基因片段后進(jìn)行直接測序。結(jié)果CHD組、MI亞組與正常對照組基因型、等位基因分布比較差異顯著(P<0.05)；朝鮮族CHD組與漢族CHD組基因型、等位基因分布比較無顯著差異(P>0.05)；單支、雙支與多支病變組基因型、等位基因分布比較無顯著差異(P>0.05)；非MI亞組與MI亞組基因型、等位基因分布比較無顯著差異(P>0.05)。結(jié)論eNOS G894T基因多態(tài)性與延邊地區(qū)老年CHD和MI有關(guān)，T等位基因可能是其易感因素。

關(guān)鍵詞〔〕冠心??；內(nèi)皮型一氧化氮合酶；基因多態(tài)性

第一作者：樸麗梅(1987-)，女，碩士，主要從事冠心病研究。

冠心病(CHD)與環(huán)境因素有關(guān)，還與遺傳危險(xiǎn)因素有關(guān)，如內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因突變。目前研究證實(shí)與CHD關(guān)系較為密切的eNOS基因突變有G894T、T786C和4b/a。其中G894T變異于1998年首次被報(bào)道與吸煙依賴性冠狀動脈痙攣(CAS)有關(guān)〔1〕，近年有對伊朗人群的研究顯示，G894T突變是CHD的一個獨(dú)立危險(xiǎn)因素〔2〕。在其他不同國家、人群中也有研究顯示其與心肌梗死(MI)有不同程度的關(guān)系。但目前尚無中國延邊地區(qū)人群的相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在探討eNOS基因G894T多態(tài)性與中國延邊地區(qū)老年CHD的相關(guān)性。

1對象與方法

1.1研究對象2013年4月～7月就診于我院心內(nèi)科住院病房的受試者63例，年齡≥65周歲。均在住院期間完成冠狀動脈造影檢查,并根據(jù)累及冠脈血管支數(shù)定義為單只、雙支及多只病變，冠脈狹窄病變累及左主干者記為雙支病變。

1.2主要設(shè)備PCR儀，購自美國Bio-Rad公司；人基因組DNA提取試劑盒，購自美國Promega公司；PCR反應(yīng)試劑，購自美國Promega公司；PCR Marker，購自日本Takara公司。

1.3血樣的采集與處理每位受試者抽取橈動脈血約4 ml,加入含有EDTA-Na2抗凝劑的離心管中。離心吸取中間白細(xì)胞層并依次按照細(xì)胞裂解、核裂解、去除RNA、沉淀蛋白質(zhì)的順序提取DNA。

1.4PCR體外擴(kuò)增目的基因片段PCR引物設(shè)計(jì)參照Hingorani等〔3〕，上、下游引物分別為：5′-CAT GAG GCT CAG CCC CAG AAC-3′；5′-AGT CAA TCC CTT TGG TGC TCA C-3′。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃，5 min 、變性95℃，30 s、退火59℃，50 s、延伸72℃，40 s、重復(fù)35個循環(huán)、最后延伸72℃，10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物與Marker一起電泳,可見片段長度為207 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物。見圖1。

M泳道為1 000 bp的Marker,1～10泳道為樣本PCR產(chǎn)物 圖1　瓊脂糖凝膠電泳檢測目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物

1.5目的基因片段的測序目的基因片段擴(kuò)增產(chǎn)物采用直接測序法，測序結(jié)果用Chromas軟件進(jìn)行分析,與人eNOS基因組第894位點(diǎn)比較，觀察有無突變。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS19.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1Hardy-Weinberg平衡性檢測人eNOS基因位于第7外顯子第894 位點(diǎn)的鳥嘌呤(G)轉(zhuǎn)換為胸腺嘧啶(T)，導(dǎo)致第298位的密碼子由谷氨酸置換為天冬氨酸(Glu298Asp)，此基因突變前后的等位基因分別稱G、T等位基因，突變后可產(chǎn)生雜合子(GT)和突變純合子(TT)。 各組間基因型分布經(jīng)χ2檢驗(yàn)均符合Hardy-Weinberg平衡定律，不存在選擇偏倚。

2.2eNOS基因G894T多態(tài)性與CHD、MI的關(guān)系CHD組與對照組基因型分布比較顯示GG基因型頻率低、GT+TT基因型頻率高(P<0.05)；等位基因分布比較顯示G等位基因頻率低、T等位基因頻率高(P<0.05)。MI亞組與對照組基因型分布比較顯示GG基因型頻率低、GT+TT基因型頻率高(P<0.05)；等位基因分布比較顯示G等位基因頻率低、T等位基因頻率高(P<0.05)。見表1。

2.3eNOS基因G894T多態(tài)性與朝鮮族、漢族CHD的關(guān)系朝鮮族CHD組與漢族CHD組基因型分布比較顯示GG基因型頻率低、GT+TT基因型頻率高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；等位基因分布比較顯示G等位基因頻率低、T等位基因頻率高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2.4eNOS基因G894T多態(tài)性與冠狀動脈病變程度的關(guān)系單支、雙支與多支病變組基因型分布比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；等位基因分布比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。MI亞組與非MI亞組基因型分布比較GG基因型頻率低、GT+TT基因型頻率高，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；等位基因分布比較G等位基因頻率低、T等位基因頻率高，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表1　三組各基因型、等位基因分布比較〔n(%)〕

與對照組比較：1)P<0.05

表2　朝鮮族與漢族CHD組各基因型、等位基因

表3　單支、雙支與多支病變組各基因型、等位基因

表4　非MI亞組與MI亞組各基因型、等位基因

3討論

內(nèi)皮功能受損在冠狀動脈粥樣斑塊形成及發(fā)展過程中作用顯著，其釋放的具有抗增生效應(yīng)的內(nèi)皮舒張因子中NO表現(xiàn)較為突出。近年研究顯示在“L-精氨酸：NO” 通路中,關(guān)鍵酶NOS的一種亞型eNOS，其基因多態(tài)性與CHD關(guān)系較為密切。G894T突變可導(dǎo)致eNOS基因第298位的谷氨酸錯譯成天冬氨酸, 而此位谷氨酸正處于α-螺旋的中心，錯譯導(dǎo)致eNOS在此處的構(gòu)象由α-螺旋變?yōu)榫o密折疊,影響蛋白構(gòu)型改變致其活性減低〔1〕。魏丹宏等〔4〕發(fā)表G894T多態(tài)性是導(dǎo)致CHD的一項(xiàng)危險(xiǎn)因素。在韓國也有研究顯示相比腦動脈粥樣硬化G894T基因多態(tài)性在促進(jìn)冠狀動脈粥樣硬化中的作用更大〔5〕,且在亞洲人群中這一特性尤為顯著〔6〕。本研究提示在中國延邊地區(qū)老年患者中，eNOS基因G894T多態(tài)性不僅與CHD有關(guān)，而且與MI關(guān)系密切。在國內(nèi)對部分無年齡限制的漢族CHD人群的研究中也發(fā)現(xiàn)eNOS基因 G894T多態(tài)性中 T等位基因頻率顯著高于正常人〔7〕, GT、TT基因型較易發(fā)生MI〔8〕。在MI的臨床治療研究方面〔9,10〕，當(dāng)外源性eNOS基因轉(zhuǎn)至體內(nèi)時NO含量增加，并刺激新生血管形成，且抑制轉(zhuǎn)化生長因子Beta-1/Smad-2信號途徑，最終對心肌梗死后心臟損傷起到保護(hù)作用。 在中國新疆維吾爾族、新疆蒙古族、新疆哈薩克族等同一地區(qū)、不同民族人群中eNOS基因G894T多態(tài)性不僅與CHD發(fā)生有關(guān)聯(lián)，且其各自攜帶的基因型、等位基因頻率也不盡相同〔11～13〕。而本研究提示eNOS基因G894T多態(tài)性在中國延邊地區(qū)朝鮮族、漢族CHD之間無明顯差異，無民族特異性。

本研究說明eNOS基因G894T多態(tài)性與CHD冠狀動脈病變范圍及冠狀動脈粥樣斑塊穩(wěn)定性均無關(guān)。這與Hingorani等〔3〕的研究結(jié)果一致，而與Gardemann等〔14〕的研究結(jié)果恰相反。提示有關(guān)eNOS基因G894T多態(tài)性與冠狀動脈粥樣硬化病變程度的關(guān)系在不同國家、種族或民族中或有差異性。

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〔2015-02-11修回〕

(編輯曲莉/滕欣航)

通訊作者：李玉子(1965-)，女，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事冠心病研究。

中圖分類號〔〕R541.4〔

文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)21-6100-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.21.044