鄒　迪　隋殿軍

(長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院腎病科，吉林　長春　130021)

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三苦滴丸抗實(shí)驗(yàn)性大鼠心肌缺血作用的炎癥機(jī)制

鄒迪隋殿軍1

(長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院腎病科，吉林長春130021)

摘要〔〕目的觀察三苦滴丸(SK)對鹽酸異丙腎上腺素所致大鼠心肌缺血的保護(hù)作用相關(guān)炎性機(jī)制。方法將大鼠隨機(jī)分為6組，空白組、模型組給予0.9%氯化鈉注射液10 ml/kg，陽性對照組給予復(fù)方丹參滴丸405 mg/kg灌胃。SK高劑量組予SK 1 600 mg/kg灌胃，SK中劑量組予SK 800 mg/kg灌胃，SK 低劑量組予SK 400 mg/kg灌胃，共給藥10 d。連續(xù)3 d腹腔注射鹽酸異丙腎上腺素5 mg/kg。第8、9天給予腹腔注射鹽酸異丙腎上腺素(5 mg/kg)，空白組給予等容量生理鹽水。于第10天灌藥后30 min，各組大鼠分別以 10%烏拉坦(0.5 ml/100 g體重)麻醉，仰位固定，腹腔注射鹽酸異丙腎上腺素(5 mg/kg)，空白組給予等容量的生理鹽水。造模成功后2 h腹主動(dòng)脈采血，檢測白細(xì)胞介素(IL)-1、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)α、血管細(xì)胞黏附因子(VCAM)-1；處死大鼠，取心臟，處理后行顯微鏡觀察；觀察SK對心肌細(xì)胞中1κB蛋白、NF-κBp65蛋白表達(dá)、NF-κB活性、NF-κBp65 mRNA基因表達(dá)的影響。結(jié)果不同劑量SK可不同程度減輕心肌缺血的程度，阻斷心肌缺血炎癥機(jī)制。結(jié)論SK對鹽酸異丙腎上腺素所致大鼠心肌缺血有良好的保護(hù)作用，可能與相關(guān)炎性機(jī)制有關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕三苦滴丸；心肌缺血；白細(xì)胞介素-1；白細(xì)胞介素-6；腫瘤壞死因子-α；血管細(xì)胞黏附因子-1

1吉林省衛(wèi)生計(jì)生委

第一作者：鄒迪(1980-)，女，主治醫(yī)師，主要從事心血管病、腎病研究。

三苦滴丸(SK)以苦碟子為主藥，三七為輔藥。三七及苦碟子單用對于心腦血管疾病均有顯著療效。本實(shí)驗(yàn)旨在探討SK對心肌缺血模型大鼠血清白細(xì)胞介素(IL)-1、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)α、血管細(xì)胞黏附因子(VCAM)-1、心肌組織結(jié)構(gòu)、心肌核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB活性、NF-κBp65 mRNA基因和蛋白表達(dá)的影響，為進(jìn)一步研究SK抗心肌缺血作用的相關(guān)炎癥機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康Wistar大鼠100只，雌雄各半，體重(200±20)g，由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供；飼料為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物顆粒飼料，由長春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)。

1.2主要試劑烏拉坦(氨基甲酸乙酯)，中國醫(yī)藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司，生產(chǎn)批號20001121；鹽酸異丙腎上腺素，上海禾豐制藥有限公司，產(chǎn)品批號110401；SK，長春中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥與生物工程研發(fā)中心；復(fù)方丹參滴丸，天津天士力制藥股份有限公司，生產(chǎn)批號110516；IL-1、IL-6、TNF-α、VCAM-1試劑盒：美國RayBiotech；細(xì)胞及組織總蛋白抽提試劑盒、BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒、蛋白預(yù)染Marker、RIPA緩沖液、HRP-結(jié)合的抗生物素抗體、一級抗體(anti-GLUT4) 、Horseradish Peroxidase(HRP)結(jié)合的二級抗體：碧云天公司；顯影液、Sangon 化學(xué)發(fā)光試劑盒、X光膠片、定影液：上海冠龍照相器材有限公司；β巰基乙醇、生物素標(biāo)記的蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)、溴酚藍(lán)、過硫酸銨等試劑：上海生工生物技術(shù)有限公司；PVDF膜：millipore公司；電泳緩沖液及丙烯酰胺：上海迪生生物技術(shù)有限公司；TrizolTM、DEPC處理水、焦碳酸二乙酯(DEPC)、逆轉(zhuǎn)錄試劑：上?；鶢栴D生物科技(上海)有限公司；氯仿 HPLC級 ：上海試劑一廠 ；FQ-PCR試劑盒：美國ABI公司；Trizol：GIBCO公司；異丙醇 HPLC級：蘇州振亞化工廠；SYBRGreen PCR試劑盒：廣州達(dá)暉生物公司；p65、NF-κB p65(E498) Antibody、IgG抗體：Cell Signaling公司。

1.3主要儀器分析天平shamg pingMD100-1，上海天平儀器廠；低速離心機(jī)：anke TDL-5-A 上海安亭科學(xué)儀器廠；顯微鏡：OLYMPUS BH2，奧林巴斯；石蠟切片機(jī)Leica RM2235，萊卡公司(奧地利)生產(chǎn)；LeicaHI1210水浴鍋，萊卡公司(奧地利)生產(chǎn)；LeicaHI1220水平干式烘干儀，萊卡公司(奧地利)生產(chǎn)；Alpha-1506P型紫外可見分光光度計(jì)，上海譜元儀器有限公司；迪瑞全自動(dòng)生化分析儀，長春迪瑞醫(yī)療科技股份有限公司；芬蘭雷勃酶標(biāo)儀,芬蘭雷勃；勻漿器(FLUKO 6-10)：德國FLUKO； 低溫冷凍離心機(jī)1-15K3K15：美國Sigma；電泳儀mini protean 3 cell： BIO-RAD公司；電轉(zhuǎn)儀，大連競邁科技有限公司；發(fā)光劑 ECLTM western blotting detection：GE healthcare；磁力攪拌器：太倉華美生化儀器廠 ；脫色搖床：麒麟貝爾儀器廠；WB圖像分析系統(tǒng) GK-330C：美國聯(lián)合生物科技有限公司；旋渦振蕩器(Vortex) XW-80A：上海青浦瀘西儀器廠；手握式電動(dòng)勻漿機(jī)FLUKO(F6-10)：德國FLUKO；干式恒溫器K10CD：杭州藍(lán)焰科技有限公司；低溫冷凍離心機(jī)1-15K 3K15、生物安全柜TYPE B2：美國Sigma；Real-time檢測儀(7300Sequence Detection System) ABI-7300：美國ABI。

1.4方法

1.4.1組別設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)用藥前各組大鼠先做心電圖檢查，棄去心律失常、ST段改變、T波異常的大鼠，將健康Wistar大鼠心電圖檢查合格者按隨機(jī)數(shù)字表分成空白組、模型組及SK低、中、高劑量組(灌服SK自制劑)和陽性對照組(灌服復(fù)方丹參滴丸)，每組10只。

1.4.2給藥方法每日分別灌胃?？瞻捉M、模型組給予0.9%氯化鈉注射液10 ml/kg，陽性對照組給予復(fù)方丹參滴丸405 mg/kg灌胃(相當(dāng)于正常成人用量的30倍)，SK高劑量組予SK 1 600 mg/kg灌胃(質(zhì)量濃度為160 mg/ml，相當(dāng)于正常成人用量的40倍)，SK中劑量組予SK 800 mg/kg灌胃(質(zhì)量濃度為80 mg/ml，相當(dāng)于正常成人用量的20倍)，SK低劑量組予SK 400 mg/kg灌胃(質(zhì)量濃度為40 mg/ml，相當(dāng)于正常成人用量的10倍)，共給藥10 d。

1.4.3造模方法連續(xù)3 d腹腔注射鹽酸異丙腎上腺素5 mg/kg。第8、9天給予腹腔注射鹽酸異丙腎上腺素(5 mg/kg)，空白組給予等容量生理鹽水。第10天灌藥后30 min，各組大鼠分別以 10%烏拉坦(0.5 ml/100 g體重)麻醉，仰位固定，腹腔注射鹽酸異丙腎上腺素(5 mg/kg)，空白組給予等容量的生理鹽水。模型成功的判斷指標(biāo):空白組與模型組心電圖進(jìn)行比較,觀察是否發(fā)生心肌缺血改變。判斷心肌缺血的心電圖標(biāo)準(zhǔn):① ST段水平向下或向上偏移≥0.1 mV； ② T波高聳超過同導(dǎo)聯(lián)R波的1/2； ③ T波高聳伴ST段移位； ④出現(xiàn)異常Q波；⑤心動(dòng)過速、早搏或其他心律失常；大鼠心電圖改變具備以上條件之一者即可判斷為心肌缺血陽性。陰性判斷標(biāo)準(zhǔn)：①S-T段斜形偏移，或水平偏移<0.1 mV；②T波低平或雙向倒置。以模型組大鼠心電圖ST段抬高≥ 0.1 mV作為造模成功的標(biāo)志。

1.4.4觀察方法造模成功2 h后腹主動(dòng)脈取血，3 000 r/min離心20 min，取血清1.5 ml，放入2 ml EP管中，存于-20℃冰箱備用，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測灌胃后心肌缺血模型大鼠血清中TNF-α含量和IL-1、IL-6、VCAM-1 含量。

造模成功后2 h腹主動(dòng)脈采血后處死大鼠，取心臟，用生理鹽水沖洗除去血污，剔盡脂肪組織等非心肌組織，順房室溝從心尖到心基底部平行將心室切開。(1)取心室肌組織修成大約1 mm3的小塊。投入預(yù)先配好的固定液中(10%甲醛)使組織、細(xì)胞的蛋白質(zhì)變性凝固，以防止細(xì)胞死后的自溶或細(xì)菌的分解，從而保持細(xì)胞本來的形態(tài)結(jié)構(gòu)。經(jīng)過脫水透明、浸蠟包埋、切片與貼片、脫蠟染色、脫水透明、封固后應(yīng)用顯微鏡觀察。(2)取心室肌組織，分析天平稱重，快速放入已標(biāo)記好的凍存管內(nèi)，置于液氮中保存?zhèn)溆?，整個(gè)過程不超過3 min。待心室全部取完，置于-80℃冰箱保存。檢測時(shí)解凍。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1顯微鏡下觀察空白組炎癥輕度，血管擴(kuò)張輕度，肌纖維斷裂輕度，纖維化輕度；模型組肌纖維斷裂嚴(yán)重，炎癥細(xì)胞嚴(yán)重，纖維化嚴(yán)重，間質(zhì)水腫嚴(yán)重，血管擴(kuò)張嚴(yán)重，肌束排列不整齊；陽性對照組可見心肌輕度纖維化，炎癥輕度，肌纖維斷裂輕度，血管擴(kuò)張輕度，間質(zhì)水腫；SK低劑量組肌纖維斷裂嚴(yán)重，炎癥細(xì)胞嚴(yán)重，纖維化嚴(yán)重，間質(zhì)水腫嚴(yán)重，血管擴(kuò)張中度，肌束排列不整齊；SK中劑量組心肌纖維化中度，炎癥細(xì)胞浸潤嚴(yán)重，肌纖維斷裂輕度，中度間質(zhì)水腫，肌束紊亂，血管擴(kuò)張輕度；SK高劑量組肌束排列整齊，炎癥細(xì)胞浸潤中度，輕度纖維化，血管輕度擴(kuò)張。

2.2SK對心肌缺血大鼠血清IL-1和IL-6變化的影響空白組、陽性對照組、SK低劑量組、SK中劑量組、SK高劑量組IL-1、IL-6顯著降低，其變化與模型組比較有非常顯著性差異(P<0.01)；與陽性對照組比較，SK高劑量組可使IL-1、IL-6活性減少，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

組別IL-1IL-6空白組66.60±19.671)68.59±19.621)模型組168.98±49.94158.90±30.61陽性對照組82.77±14.601)86.84±14.611)SK低劑量組76.89±17.681)92.47±9.691)SK中劑量組87.69±17.311)83.79±9.761)SK高劑量組70.90±16.401)82.79±12.051)

與模型組比較：1)P<0.01

2.3SK對心肌缺血大鼠血清TNF-α和VCAM-1變化的影響見表2?？瞻捉M、陽性對照組、SK低劑量組、SK中劑量組、SK高劑量組TNF-α顯著降低，其變化與模型組比較差異顯著(P<0.01)；與陽性對照組比較，SK高、中劑量組可使TNF-α活性減少，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)?？瞻捉M、陽性對照組、SK低劑量組、SK中劑量組、SK高劑量組VCAM-1顯著降低，其變化與模型組比較差異顯著(P<0.05)；但SK高、中、低劑量組作用不及陽性對照組。

2.4SK對心肌細(xì)胞中IκB蛋白表達(dá)的影響空白組、陽性對照組、SK低、中、高劑量組IκB蛋白表達(dá)顯著升高(2.917±0.220，2.795±0.775，1.673±0.365，1.741±0.161，1.836±0.169)，其變化與模型組(0.957±0.508)比較有顯著差異(P<0.05，P<0.01)。

組別TNF-α(pg/ml)VCAM-1(μg/L)空白組345.07±178.102)162.83±20.821)模型組803.08±292.14319.33±38.32陽性對照組456.02±165.082)201.53±29.221)SK低劑量組500.15±61.772)205.52±34.342)SK中劑量組422.76±35.782)243.81±31.721)SK高劑量組426.79±41.492)208.59±35.791)

2.5SK對實(shí)驗(yàn)性心肌缺血大鼠心肌NF-κB活性、NF-κBp65 mRNA和蛋白表達(dá)的影響空白組、陽性對照組、SK低、中、高劑量組NF-κBp65蛋白表達(dá)降低(11 041.56±2 458.59，11 507.00±3 539.74，13 067.89±1 792.62，12 484.33±4 534.51，12 830.11±4 346.18)，其變化與模型組(16 816.00±3 389.14)比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。NF-κBp65 mRNA基因表達(dá)也降低〔(0.139±0.053)%，(0.471±0.212)%，(0.453±0.081)%，(0.360±0.080)%，(0.302±0.113)%〕，其變化與模型組〔(0.732±0.188)%〕比較差異顯著(P<0.05，P<0.01)；SK高、中、低劑量組均數(shù)小于陽性對照組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)?？瞻捉M、陽性對照組、SK低、中、高劑量組NF-κB活性表達(dá)降低(5 456.250±695.490，8 262.484±720.988，10 521.796±1 045.135，10 423.276±1 347.474，7 666.390±1 139.444)，其變化與模型組(14 181.782±1 367.063)比較有顯著性差異(P<0.05)；SK高劑量組小于陽性對照組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3討論

心肌缺血損傷時(shí)，心肌超微結(jié)構(gòu)變化主要表現(xiàn)為細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜完整性破壞，如線粒體腫脹、嵴斷裂、溶解和空泡形成，基質(zhì)致密顆粒增多，并伴有大量的鈣沉積、肌纖維斷裂、節(jié)段性溶解和出現(xiàn)收縮帶等。這些超微結(jié)構(gòu)的改變被認(rèn)為是心肌缺血時(shí)由可逆性損傷向不可逆性損傷改變的病理標(biāo)志。本研究根據(jù)蘇木素-伊紅(HE)染色結(jié)果提示，SK可減輕心肌結(jié)構(gòu)損傷。

在心肌缺血的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸中，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可以調(diào)控心肌細(xì)胞的損傷。心肌缺血時(shí)存在著廣泛而復(fù)雜的信號傳導(dǎo)系統(tǒng)交匯，并對缺血心肌發(fā)揮網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的作用，因此多種細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的交匯和相互作用在疾病的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮著非常重要的作用。NF-κB能與位于多種細(xì)胞基因上的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子序列片段特異性位點(diǎn)發(fā)生特異性結(jié)合，上調(diào)多種細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，與機(jī)體許多炎癥、免疫性相關(guān)基因的表達(dá)關(guān)系最密切，從而參與很多與免疫、炎癥和應(yīng)激有關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄。IκBα是NF-κB的主要調(diào)控蛋白〔1～6〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SK可抑制NF-κBp65蛋白表達(dá)，減輕心肌缺血，抑制NF-κBp65 mRNA基因表達(dá)，抑制NF-κB活性，減輕心肌缺血。提示SK可升高心肌組織中IκB蛋白表達(dá)，從而抑制NF-κB。

在心肌缺血時(shí)，各種炎癥細(xì)胞因子往往共同發(fā)生作用，具有非常密切的相互關(guān)系。一種細(xì)胞因子可以影響另一種細(xì)胞因子對其靶細(xì)胞的作用，一種細(xì)胞因子還可以刺激其他細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，炎癥細(xì)胞一旦釋放到血管外，會(huì)促發(fā)更多的細(xì)胞因子釋放，并誘導(dǎo)損傷區(qū)中性粒細(xì)胞聚集、浸潤，導(dǎo)致影響神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞基因的表達(dá)，由此形成惡性循環(huán)，加重炎癥損傷。因此，炎癥標(biāo)志物的變化及相互作用應(yīng)當(dāng)是心血管病過程中的關(guān)鍵分子，作為檢測指標(biāo)對疾病的發(fā)生發(fā)展與預(yù)測預(yù)后具有重要價(jià)值，監(jiān)測其濃度變化有重要意義。本研究提示SK可降低心肌缺血模型大鼠TNF-α、VCAM-1，從而起到保護(hù)缺血心肌的作用。

綜上所述，SK能有效地抗大鼠心肌缺血，其作用機(jī)制可能與SK抑制NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上游激酶的活化、上調(diào)IκB-α在心肌細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)，從而阻止NF-κB核移位、降低NF-κB的活性、減少其轉(zhuǎn)錄調(diào)控的炎性因子的釋放、抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)。通過多種作用機(jī)制共同作用，起到保護(hù)心肌細(xì)胞、抗心肌缺血損傷的作用。

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〔2015-06-24修回〕

(編輯曲莉)

通訊作者：隋殿軍(1955-)，男，教授，主要從事心血管病研究。

基金項(xiàng)目：國家科技重大專項(xiàng)資助課題(No.2009ZX09102-115)

中圖分類號〔〕R541〔

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)23-6655-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.23.006