黃　俊　張明霞　黃江燕　萬　歡

(南昌大學第一附屬醫(yī)院心內科，江西　南昌　330006)

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1型糖尿病大鼠心肌纖維化中微血管內皮細胞間質轉分化的鑒定

黃俊張明霞1黃江燕萬歡

(南昌大學第一附屬醫(yī)院心內科，江西南昌330006)

摘要〔〕目的鑒定鏈脲佐菌素(STZ)誘導的1型糖尿病大鼠心肌纖維化中是否發(fā)生了心肌微血管內皮細胞-間質轉分化。方法STZ誘導大鼠心肌纖維化，12 w超聲心動圖檢測大鼠心功能指標，VG染色觀察心肌組織膠原含量變化，免疫組化鑒定心肌組織中微血管內皮細胞間質轉分化。結果心臟超聲提示實驗組大鼠左室前后壁厚度(LVWT)、左室舒張末期內徑(LVEDD)、左室收縮末期內徑(LVESD)明顯大于對照組，左室射血分數(shù)(LVEF)和左室短軸縮短率(FS)明顯小于對照組(P<0.05)。心肌VG染色實驗組粉紅色膠原組織增多，而對照組僅有少許紅色膠原組織表達。心肌免疫組化染色觀察，實驗組與對照組CD31、α-平滑肌肌動蛋白(SMA)均表達陽性，但實驗組CD31表達減弱(P<0.05)、微血管壁α-SMA表達增強(P<0.05)。免疫酶雙染技術檢測，對照組微血管內皮被染為棕黃色，實驗組微血管內皮紅色染色較強，而棕黃色較弱。結論STZ誘導的1型糖尿病大鼠心肌纖維化過程中發(fā)生了心肌微血管內皮細胞-間質轉分化。

關鍵詞〔〕糖尿??；內皮細胞；間質轉分化

1杭州市蕭山區(qū)第二醫(yī)院內科

第一作者：黃俊(1968-)，男，醫(yī)學博士，主任醫(yī)師，教授，碩士生導師，主要從事冠心病防治及介入治療研究。

糖尿病心肌纖維化在糖尿病心肌病、心力衰竭的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。成纖維細胞過度增殖活化、細胞外基質大量產生過度沉積是心肌纖維化的主要原因。針對成纖維細胞的來源，源頭控制纖維化的發(fā)生發(fā)展，開始引起人們的興趣。研究發(fā)現(xiàn)微血管內皮細胞-間質轉分化(EndMT)途徑可生成大量的成纖維細胞、肌纖維母細胞〔1，2〕。本研究擬建立1型糖尿病大鼠心肌纖維化模型，鑒定其中是否發(fā)生了EndMT現(xiàn)象。

1材料與方法

1.1材料30只雄性SD大鼠，體質量(170±5.85)g，隨機分為實驗組和對照組，每組15只。實驗動物按照南昌大學醫(yī)學院動物倫理委員會規(guī)定執(zhí)行。鏈脲佐菌素(STZ)；血糖儀(強生穩(wěn)豪)；GE VIVI7超聲診斷系統(tǒng)(探頭頻率12 MHz，美國)；α-平滑肌肌動蛋白(SMA)、CD31抗體(博士德)；免疫組化Elivision plus試劑盒(福州脈新生物)；Polymer雙染檢測試劑盒(北京中杉金橋生物)。

1.2方法

1.2.1建立大鼠糖尿病心肌纖維化模型實驗組大鼠單次腹腔注射STZ(60 mg/kg)制作1型糖尿病心肌纖維化模型。對照組腹腔注射等量檸檬酸緩沖液。STZ注射后72 h，尾靜脈采血測隨機血糖，剔除血糖<16.7 mmol/L大鼠。每周測大鼠體質量、血糖1次，血糖≥16.7 mmol/L即認為模型建立成功。

1.2.2心臟功能檢測建模后12 w超聲心動圖檢測。大鼠麻醉固定仰臥略向左傾斜位后獲取胸骨旁左室長軸切面二維及M型超聲圖像，測量左心室射血分數(shù)(LVEF)，左室前、后壁厚度(LVWT)，左室舒張末期內徑(LVEDD)，左室收縮末期內徑(LVESD)和左心室短軸縮短率(FS)。

1.2.3心肌VG染色組織學檢查麻醉、處死大鼠，取左心室心肌組織，10%PBS中性甲醛固定，脫水、透明、石蠟包埋后制成切片，VG染色觀察心肌組織膠原含量變化，Image-Pro Plus 4.0圖像分析系統(tǒng)測量心肌組織膠原容積分數(shù)(CVF)=膠原面積/總面積。

1.2.4免疫酶組化鑒定EndMTElivison二步法：切片按免疫組化常規(guī)處理，微波法修復抗原，分別加入小鼠來源的α-SMA一抗和兔來源的CD31一抗，并設陰性對照，每張切片加1滴酶標抗鼠/兔聚合物；顯色，蘇木素襯染，脫水、透明、封片。顯微鏡觀察并拍照。Polymer雙染檢測：切片脫蠟和水化方法同Elivison二步法，微波法修復抗原，加入足量的兩種一抗混合物(小鼠來源的α-SMA一抗和兔來源的CD31一抗)于切片上，同時設陰性對照，每張切片加入50～100 μl 混合二抗，鏡下觀察顯色情況，蘇木素復染，自來水沖洗，放入PBS中返藍，滴加封片劑。顯微鏡觀察并拍照。

1.3統(tǒng)計學方法采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗。

2結果

2.1兩組大鼠生存率、血糖、心臟功能及心肌組織學改變實驗組與對照組大鼠生存率分別為93.3%和100%；實驗組大鼠血糖均>16.7 mmol/L，對照組在5.6～7.4 mmol/L。超聲檢測實驗組大鼠LVWT、LVEDD和LVESD明顯大于對照組；LVEF和左心室FS明顯小于對照組(P<0.05)(表1)。心肌VG染色實驗組粉紅色膠原組織增多，對照組黃色心肌組織內僅有少許粉紅色膠原組織表達；膠原半定量分析：對照組CVF(1.93±0.45)%明顯少于實驗組CVF〔(8.35±1.02)%，P<0.05〕。

2.2Elivison二步法結果比較光學顯微鏡觀察封片，Image-Pro Plus 4.0圖像分析系統(tǒng)計算機讀片，以陽性染色區(qū)域的積分光密度值做半定量分析。實驗組與對照組CD31均表達陽性，但實驗組CD31表達減弱(P<0.05)。實驗組與對照組α-SMA均表達陽性，但實驗組心肌組織微血管壁α-SMA表達增強(P<0.05)(表2)，提示實驗組中微血管內皮細胞性質已向間質樣細胞轉化。

組別LVEF(%)LVWT(cm)LVEDD(cm)LVESD(cm)左心室FS(%)對照組87±2.30.15±0.010.55±0.020.25±0.0155±1.78實驗組63±2.21)0.20±0.011)0.69±0.021)0.45±0.021)32±1.321)

與對照組比較：1)P<0.05，下表同

組別α-SMACD31對照組3.2137±0.15262.3264±0.2769實驗組8.2256±0.14361)1.4384±0.17981)

2.3Polymer雙染檢測結果對照組微血管內皮被染為棕黃色，而實驗組微血管內皮紅色染色較強，黃色染色較弱(圖1)。提示實驗組中微血管內皮細胞已發(fā)生間質轉分化。

圖1　光學顯微鏡觀察各組大鼠心肌細胞橫切面Polymer雙染色(×40)

3討論

糖尿病心肌纖維化是糖尿病嚴重并發(fā)癥之一，在糖尿病心肌病、心力衰竭的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。心肌成纖維細胞占心肌細胞總數(shù)的60%～70%，病理條件下由自身增殖及骨髓來源而過度增殖活化，過度產生細胞外基質在心肌纖維化中發(fā)揮作用〔3〕。近來發(fā)現(xiàn)成纖維細胞除上述來源，EndMT途徑也生成大量的成纖維細胞、肌纖維母細胞〔1〕。

EndMT是由于炎癥因子、機械損傷、缺氧等刺激微血管內皮細胞，使細胞間緊密連接破壞，喪失黏附特性從基底膜脫落，胞質內細胞骨架重排，表達α-SMA、成纖維細胞特異蛋白-1等表型蛋白，胞質內肌絲從上皮型的角蛋白轉變?yōu)殚g質細胞的波形蛋白，細胞形態(tài)由卵石狀變成梭形，類似成纖維細胞、肌纖維母細胞，并具備相應的功能，在組織器官的纖維化進程中發(fā)揮作用〔4〕。Zeisberg等〔5〕用STZ誘導的小鼠糖尿病腎病模型中，幾乎30%～50%的成纖維細胞同時表達內皮細胞標志CD31和成纖維細胞、肌成纖維細胞標志人纖維母細胞素面抗原(FSP)-1、α-SMA，提示某些病理情況下EndMT來源的成纖維細胞占到了某些組織器官成纖維細胞總數(shù)的1/3～1/2。

本實驗提示實驗組內皮細胞性質樣細胞減少，微血管內皮細胞已向成纖維樣細胞轉化。Polymer雙染檢測試劑盒檢測發(fā)現(xiàn)，對照組微血管內皮被染為棕黃色，而實驗組微血管內皮紅色染色較強，黃色染色較弱，進一步表明對照組微血管內皮細胞未發(fā)生間質轉分化；而實驗組中微血管內皮細胞已發(fā)生間質轉分化，說明在STZ誘導的1型糖尿病大鼠心肌纖維化中，EndMT現(xiàn)象也同樣存在。而通過EndMT途徑生成的成纖維細胞在細胞外基質代謝中的作用有待于進一步研究。

參考文獻4

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2Zeisberg EM，Tarnavski O，Zeisberg M，etal.Endothelial-to-mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis〔J〕.Nat Med,2007；13(8)：952-61.

3Krenning G，Zeisberg EM，Kalluri R.The origin of fibroblasts and mechanism of cardiac fibrosis〔J〕.J Cell Physiol,2010；225(3)：631-7.

4Willis BC，duBois RM，Borok Z.Epithelial origin of myfibroblasts during fibrosis in the lung〔J〕.Proc Am Thorac Soc,2006;3(4)：377-82.

5Zeisberg EM，Potenta SE，Sugimoto H，etal.Fibroblasts in kidney fibrosis emerge via endothelial to mesenchymal transition〔J〕.J Am Soc Nephrol,2008；19(12)：2282-7.

〔2014-07-20修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

基金項目：江西省自然科學基金(20132BAB205034)；江西省教育廳資助項目(GJJ12059)

中圖分類號〔〕R587〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)23-6653-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.23.005