耿艷艷，于　冰，周植星，胡倩倩，徐為人，湯立達

(1.天津醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院, 天津　300070； 2.天津藥物研究院，天津市新藥設計與發(fā)現(xiàn)重點實驗室，天津　300193)

甘草次酸衍生物TY501抗肺纖維化作用及機制研究

耿艷艷1,2，于冰2，周植星2，胡倩倩1,2，徐為人2，湯立達2

(1.天津醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院, 天津300070； 2.天津藥物研究院，天津市新藥設計與發(fā)現(xiàn)重點實驗室，天津300193)

中國圖書分類號：R-332；R284.1；R322.35；R563.130.22

摘要：目的探索甘草次酸衍生物TY501對博萊霉素(BLM)誘導的肺纖維化模型大鼠的抗肺纖維化作用及初步機制。 方法將40只大鼠隨機分成5組：假手術組、模型組、吡非尼酮組、TY501高劑量組和低劑量組。經(jīng)氣道給予BLM制備大鼠肺纖維化模型，每天灌胃給予受試藥。實驗結束后，測定肺系數(shù)、氧分壓(PaO2)，測定BALF中ALB、ALP、LDH以及肺組織中GSH、HYP含量，測定血清Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、Ⅳ型膠原(COL4)含量。結果① 肺纖維化早期肺泡炎階段相關指標：各治療組與模型組相比，肺系數(shù)顯著下降(P<0.05)、PaO2明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，各治療組大鼠BALF中ALP、ALB以及LDH呈下降趨勢(P<0.05)；模型組肺組織勻漿中GSH含量反饋性增高，與假手術組相比存在明顯差異(P<0.05)，各治療組較模型組含量降低(P<0.05)；(2)肺纖維化晚期肺間質(zhì)纖維化階段：大鼠肺組織HYP、血清PCⅢ(TGF-β通路指標)、血清COL4(MMPs通路指標)含量，各治療組較模型組呈下降趨勢，差異有顯著性(P<0.05)。 結論TY501對肺纖維化治療存在價值，能夠減輕BLM誘導的肺纖維化程度。TY501可能通過阻斷TGF-β的作用、抑制MMPs等多途徑抑制肺纖維化的發(fā)生，減輕肺纖維化癥狀。

關鍵詞：甘草次酸衍生物；TY501；特發(fā)性肺纖維化；博來霉素；轉化生長因子-β；基質(zhì)金屬蛋白酶

2011年，特發(fā)性肺纖維化(IPF)循證醫(yī)學指南中，將IPF定義為:一種病因不明的慢性纖維化性間質(zhì)性肺炎，組織學和(或)胸部高分辨CT特征性表現(xiàn)為普通性間質(zhì)性肺炎(UIP)的疾病[1]。目前最常用復制肺纖維化動物模型方法是氣管內(nèi)注入博萊霉素(bleomycin，BLM)，且這一動物模型被認為是最近似于 IPF 病理改變的模型[2]。甘草次酸及其衍生物具有廣泛的藥理作用，如抗炎、抗病毒、抑菌、保肝、解毒、抗腎損傷、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)以及祛痰、抗氧化等等。但是，臨床上應用該藥常伴有假醛固酮增多癥，表現(xiàn)為患者長期用藥后出現(xiàn)水腫、濕疹、低血鉀和鈉潴留等不良反應。本課題組對甘草次酸母核進行改造，以脫氧甘草次酸為母體，在11位引入取代基異惡唑甲酰胺的取代基團，合成甘草次酸衍生物-TY501(Fig 1)，并申請專利[3]。前期研究[4-5]表明，TY501抗炎、鎮(zhèn)痛、抗肝損傷、抗腎損傷、抗胃潰瘍等方面具有良好的效果，且長期給藥毒性低，具有很好的成藥性。本實驗就 TY501對抗肺纖維化作用機制進行初步探索，希望為臨床治療肺纖維化提供新的藥物。

1材料

1.1實驗動物SPF級♂ SD大鼠40只，體質(zhì)量(204±19) g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物合格證號：SCXK(京)2012-0001。

Fig 1Structure of TY501

1.2主要藥品及試劑博萊霉素(15 mg一瓶，日本化藥株式會社)；TY501(白色粉末，含量為97.8%，批號20100512，由天津藥物研究院創(chuàng)新中心提供，實驗前用5 g·L-1CMC-Na配制成適當濃度)；羧甲基纖維素鈉800-1200(CMC-Na，化學純，批號F20081015，國藥集團化學試劑有限公司)；吡非尼酮(pirfenidone，PFD，淡黃色白色粉末，5 g一瓶)；堿性磷酸酶(ALP)試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司)；白蛋白(ALB)試劑盒、微量還原型谷胱甘肽測試盒、羥脯氨酸測試盒(南京建成生物工程研究所)；Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、Ⅳ型膠原(COL4)ELISA試劑盒(Cloud-Clone公司)。

1.3主要儀器Sartorius BS124S 電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；HS3120 超聲波清洗器(天津市恒奧科技發(fā)展有限公司)；LDS-2A 型臺式低速離心機(北京醫(yī)用離心機廠制造)；TGL-16B 型臺式高速離心機(上海安亭科學儀器廠)SELECTAA-2 型自動生化分析儀(荷蘭威圖公司)；酶標儀(SUNRISE)；i-STAT300型血氣分析儀(美國雅培公司)。

2方法

2.1動物分組及模型建立將40只 SD 大鼠隨機分成 5 組。假手術組、模型組、吡非尼酮(50 mg·kg-1)組、TY501高劑量組(60 mg·kg-1)、TY501低劑量(30 mg·kg-1)組各8只。大鼠腹腔注射水合氯醛(360 mg·kg-1)麻醉，仰臥固定，經(jīng)口行氣管插管，并經(jīng)插管緩慢注入0.2~0.3 mL BLM，劑量為5 mg·kg-1，然后迅速直立并旋轉動物，使藥液在肺內(nèi)均勻分布；假手術組操作同上，氣管內(nèi)注入生理鹽水0.3 mL。術后d 2開始給藥，每天1次，連續(xù)給予21 d，假手術組及模型組給予5 g·L-1CMC-Na。

2.2指標測定

2.2.1肺系數(shù)測定末次給藥后，腹腔注射水合氯醛(360 mg·kg-1)麻醉，分離肺臟，稱取肺濕重(mg)，測量脛骨長度(mm)，計算肺臟/脛骨比值。

2.2.2血氣分析末次給藥后，經(jīng)腹主動脈取血1 ml，進行血氣分析，測定氧分壓(PaO2)。

2.2.3BALF中ALB、ALP、LDH含量測定分離肺臟后，以37℃無菌生理鹽水對肺臟行灌洗(5 mL×2)。收集肺泡灌洗液(BALF)，記錄回收量，1 200 r·min-1離心10 min，分裝后-80℃凍存。按照試劑盒方法測定BALF中ALB、ALP、LDH含量。

2.2.4肺組織勻漿谷胱甘肽(GSH)含量測定稱取100 mg肺組織，加入1 mL NS進行肺組織勻漿，將勻漿液2 000 r·min-1離心10 min，取上清按照試劑盒方法檢測GSH含量。

2.2.5肺組織羥脯氨酸(HYP)含量測定采用Jamall法[6]，稱取100 mg肺組織(濕重)，測定HYP含量。

2.2.6血清Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、Ⅳ型膠原(COL4)含量測定經(jīng)腹主動脈取血2 mL，離心，取血清，采用ELISA法測定血清Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、Ⅳ型膠原(COL4)含量，嚴格按說明書操作步驟進行操作。通過酶標儀比色，得出吸光度A值。由標準曲線計算出樣品中膠原含量。

3結果

3.1肺系數(shù)及動脈血氣分析指標氧分壓變化d 21時，模型組肺系數(shù)明顯高于假手術組(P<0.05)，氧分壓則降低(P<0.05)；吡非尼酮組、TY501高、低劑量組肺系數(shù)相比模型組均呈下降趨勢(P<0.05)，氧分壓則升高，且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見Fig 2。

3.2BALF中ALB、ALP、LDH含量變化d 21時，模型組較假手術組呈升高趨勢，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；治療組與模型組比較，BALF中ALB、ALP、LDH含量下降趨勢明顯(P<0.05)，見Fig 3。

3.3肺組織勻漿中GSH含量變化d 21時，模型組GSH含量較假手術組升高，且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；治療組與模型組比較，GSH含量下降趨勢明顯(P<0.05)。見Fig 4。

#P<0.05vssham group;*P<0.05vsmodel group, same as below

Fig 3　Changes of ALB(A),ALP(B),LDH(C)in BALF

#P<0.05vssham;*P<0.05vsmodel

Fig 4Changes of GSH in lung tissue homogenate of

#P<0.05vssham;*P<0.05vsmodel

3.4大鼠肺組織中HYP以及血清PC-Ⅲ、COL4含量變化d 21時，模型組肺組織HYP含量明顯高于假手術組(P<0.01)，治療組HYP含量均較模型組降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。模型組血清PC-Ⅲ、COL4含量明顯高于假手術組(P<0.01)。TY501高、低劑量組血清PC-Ⅲ含量低于模型組(P<0.05)，而吡非尼酮組與模型組相比無明顯差異(P>0.05)。治療組血清COL4含量與模型組相比呈下降趨勢，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中TY501高劑量組較模型組差異有顯著性(P<0.01)。見Tab 1。

Tab 1Contents of HYP,PC-Ⅲ,COL4

GroupDose/mg·kg-1HYPcontent/μg·g-1PC-Ⅲcontent/μg·g-1COL4content/μg·g-1Sham-67.9±20.49.3±2.6263.2±70.3Model-120.8±27.8#16.4±4.2#496.3±111.1#PFD5067±24.1*10.7±3.1353±76.1*TY501-H6075.8±26.4*10.4±1*292.2±68.5**TY501-L3087.7±18.7*11.1±2.1*329.5±132.8*

#P<0.05vssham;*P<0.05;**P<0.01vsmodel

4討論

4.1IPF發(fā)生機制及主要測定指標IPF主要表現(xiàn)為彌漫性肺間質(zhì)纖維化，伴隨輕度炎癥、成纖維細胞灶與正常肺組織并存、細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的大量增生和沉積、蜂窩組織的形成。肺間質(zhì)纖維化早期以肺泡炎為主，后期成纖維細胞大量增生、膠原沉積，逐漸發(fā)展為不可逆的肺間質(zhì)纖維化[7-8]。

肺泡炎階段常見指標包括BALF中ALB、ALP、LDH、肺組織GSH等。組織學研究[9]表明，IPF患者Ⅱ型上皮細胞ALP明顯增多，它參與組織損傷和修復，參與局部免疫和防御反應；由氣道上皮細胞產(chǎn)生的LDH在肺泡炎癥性損傷后可明顯增高，用以反映炎癥損傷嚴重程度。IPF肺泡炎階段，致病因子導致肺泡上皮細胞受損，肺部ROS病理性增多，ROS可通過脂質(zhì)過氧化損傷、蛋白質(zhì)損傷、DNA損傷、細胞因子網(wǎng)絡失衡等途徑導致肺間質(zhì)纖維化。谷胱甘肽(GSH)是一種重要的抗氧化劑，已發(fā)現(xiàn)主要存在于肺泡上皮襯液(ELF)中，肺內(nèi)局部GSH缺乏加重由氧自由基釋放量增加造成的肺泡上皮細胞損傷。

肺間質(zhì)纖維化過程包括大量的成纖維細胞聚集、ECM沉積、膠原形成并伴有炎癥和損傷所致的組織結構破壞為特征。轉化生長因子β(TGF-β)被認為是纖維化形成與發(fā)展的啟動樞紐，能促進多種ECM成分(如COL1、COL3)的合成、成纖維細胞增殖和生長以及阻止ECM降解，在器官纖維化過程中存在不同程度的表達。HYP是膠原纖維中特有的一類氨基酸，其他組織幾乎不含有HYP；PCⅢ是COL3的前身，它由產(chǎn)生膠原的細胞合成后被分泌到細胞外，在內(nèi)切酶作用下，前膠原釋放羧基和氨基末端多肽(即PⅢP)后轉化為原膠原分子，然后原膠原分子交聯(lián)成膠原纖維，二者可作為TGF-β的下游指標或肺纖維化程度指標。此外，IPF兩個階段均有ECM代謝失衡的變化[10]，肺組織ECM的處于增生與降解的動態(tài)平衡，增生主要由肺成纖維細胞與Ⅱ型上皮細胞增殖活化引起，降解則由基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)與絲氨酸蛋白酶等蛋白酶所調(diào)節(jié)。MMPs根據(jù)降解的底物不同可分為3類(Tab 2)[11]。當肺組織中MMPs表達及活性增高時， 肺組織中正常膠原蛋白被纖維性間質(zhì)取代，最終導致肺纖維化的形成。MMP-2、MMP-9的作用底物主要是ECM成分中Ⅳ型膠原(COL4)。纖維化過程中，COL4等ECM成分在增生同時又有降解，組織結構的反復破壞與重構，最終導致肺纖維化。綜上，COL4的測定對MMPs通路具有重要意義。

Tab 2　Types of MMPs (according to substrate species)

4.2吡非尼酮抗IPF主要機制2011年IPF循證醫(yī)學指南[1]指出，基于發(fā)表的循證醫(yī)學的資料結果顯示，至今尚無證實有特效治療IPF的藥物。目前唯一被部分國家批準用于IPF治療的藥物就是吡非尼酮，該藥于2011年9月獲得我國SFDA的新藥證書，2014年7月FDA宣布認定吡非尼酮為IPF突破性治療藥物，這意味著FDA會推進該藥的研發(fā)并加快復審[12]。故本實驗中采用吡非尼酮為陽性對照藥物，實驗結果更有價值。

吡非尼酮是口服的吡啶類藥物，能調(diào)節(jié)許多細胞因子，包括TGF-β、結締組織生長因子(connective tissue growth factor, CTGF)、血小板衍生因子(platelet derived growth factor，PDGF)和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)α，改變膠原表達合成和累積，抑制細胞外基質(zhì)增殖和表達[13]，具有抗炎、抗氧化及抗纖維化的作用。PFD 能夠減少MMPs的表達，調(diào)節(jié)平滑肌細胞增殖和遷移[14]，抑制 NAPDH 相關的脂質(zhì)過氧化反應。Iyer等[15]證實吡非尼酮可以抑制纖維化肺組織的脯氨酸羥化酶的活性，減少HYP的生成，抑制Ⅰ型、Ⅲ型膠原基因的轉錄，減少肺膠原的含量。本實驗吡非尼酮組炎性指標與模型組相比較，均明顯降低；HYP、PCⅢ、COL4晚期肺間質(zhì)纖維化指標較模型組呈下降趨勢，與Iyer實驗結果一致，表明本實驗可靠性。

我們采用BLM誘導大鼠肺纖維化模型，從實驗結果分析可知：各指標組內(nèi)差異小，結果穩(wěn)定；與假手術組相比較，肺泡炎性指標均升高，即BLM已經(jīng)導致大鼠肺組織炎性損傷；HYP、PCⅢ、COL4含量較假手術組升高，與金曉光等[7]實驗結果一致，表明本次實驗建模成功，所測指標可信度高。

4.3TY501作用機制

4.3.1IPF肺泡炎階段實驗d 21時，TY501高、低劑量組BALF中ALP、ALB、LPH含量較模型組呈下降趨勢，與陽性對照藥物吡非尼酮組趨勢一致，同時與鄭銳等[16]的研究結果一致。提示TY501可緩解肺纖維化大鼠肺泡炎癥，降低炎癥損傷程度，減輕大鼠肺纖維化癥狀。

劉瑞等[17]研究顯示，模型組大鼠IPF初期肺泡炎明顯，實驗d 3、d 7時，作為細胞內(nèi)最豐富的抗氧化劑，GSH在細胞清除ROS過程中發(fā)揮關鍵作用，尤其在肺纖維化早期炎癥階段大量耗竭，14、28 d時，GSH反饋性增高，提高肺臟抗氧化能力以對抗氧自由基，保護肺組織免受氧化損傷。本實驗中，模型組大鼠GSH含量高于假手術組(P<0.05)，治療組大鼠GSH含量低于模型組(P<0.05)；這表明TY501對肺組織損傷具有保護作用，而TY501能否在肺炎初期促進GSH合成，有待進一步研究。

4.3.2IPF肺間質(zhì)纖維化階段本實驗結果表明，兩個劑量TY501組、吡非尼酮組肺纖維化大鼠肺組織HYP含量均低于模型組，差異有顯著性；ELISA法所檢測的Ⅲ型前膠原(PCⅢ)含量治療組較模型組明顯降低。由此可得出：TY501與吡非尼酮作用效果一致，能夠降低IPF大鼠肺組織中HYP含量、膠原含量、ECM沉積，提示TY501可通過影響ECM的合成而發(fā)揮抗肺纖維化。由前文敘述可知，HYP、PCⅢ的降低與TGF-β有關，吡非尼酮主要機制即抑制TGF-β作用，故推測TY501與吡非尼酮相似，其抗肺纖維化作用與對TGF-β具有抑制作用有關。

肺纖維化大鼠肺組織中MMPs蛋白呈高表達，其中MMP-2可通過降解破壞正常肺組織的Ⅳ型膠原，而促進肺成纖維細胞等活化與肺纖維化，研究證明[14]吡非尼酮抗肺纖維化與此有關。本實驗結果顯示d 21，高、低劑量TY501、吡非尼酮明顯降低IPF大鼠異常升高的肺組織Ⅳ型膠原，提示TY501可通過抑制膠原蛋白病理增生而發(fā)揮抗肺纖維化作用。推測TY501的作用機制與吡非尼酮一致，能夠抑制MMPs表達以及活性，以減輕纖維化肺組織炎癥、組織破壞與ECM生成細胞活化。MMP-2在此過程中含量以及表達情況還有待進一步的深入研究。

4.4小結本次實驗采用經(jīng)氣道給予BLM制備大鼠特發(fā)性肺纖維化模型，與假手術組相比，肺纖維化大鼠各個炎性指標均呈升高趨勢，均能發(fā)生肺部炎癥、ECM沉積、膠原生成等。陽性對照藥吡非尼酮抗肺纖維化機制較明確，本實驗中吡非尼酮組與模型組相比所得結果與文獻報道一致，結果可靠。TY501高劑量組(60 mg·kg-1)、低劑量組(30 mg·kg-1)對IPF大鼠模型均表現(xiàn)出治療作用，與吡非尼酮一致，即TY501能夠減輕肺大鼠肺纖維化程度，對肺纖維化治療具有重要價值。

TY501能夠減輕肺部炎癥損傷，HYP、PCⅢ含量較模型組減少，我們推測TY501與吡非尼酮類似，能夠抑制TGF-β作用，阻斷與其相關的通路如TGF-β/Smads信號傳導通路，抑制成纖維細胞激活、膠原產(chǎn)生，在肺纖維化的形成過程中發(fā)揮重要作用。MMPs對肺纖維化中肺組織ECM的降解具有關鍵作用，IPF大鼠給予TY501后，COL4(MMPs下游指標)含量較模型組降低，我們推測TY501對該通路也具有一定作用。

總而言之，TY501極有可能為多通路抗IPF藥物，期待進一步研究所得到的結果，為改善IPF患者的生活質(zhì)量和延長生命做出努力。

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網(wǎng)絡出版時間：2015-1-9 13:37網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.3969/j.issn.1001-1978.2015.02.013.html

Antifibrotic effect of TY501 on bleomycin-induced pulmonary fibrosis

in rats and related mechanism

GENG Yan-yan1,2, YU Bing2, ZHOU Zhi-xing2, HU Qian-qian1,2, XU Wei-ren2, TANG Li-da2

(1.BasicMedicalCollege,TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China; 2.TianjinKeyLaboratoryofMolecularDesignand

DrugDiscovery,TianjinInstituteofPharmaceuticalResearch,Tianjin300193,China)

Abstract:AimTo investigate TY501′s role in bleomycin(BLM)-induced pulmonary fibrosis in rats．MethodsForty rats were randomly divided into 5 groups, including the sham operation, BLM, PFD, TY501(high and low dose) groups. After administration of BLM intratracheally, PFD and TY501 were given in each group daily, according to the dosage designed during 21 days．Lung coefficient, PaO2were tested before killing the rats. The contents of ALB, ALP, LDH, GSH, HYP were detected by regent kit respectively. PCⅢ and COL4 were determined by ELISA. Results(1)Some indicators of alveolitis in early stage of IPF: the contents of lung coefficient in three treatment groups were lower and PaO2was higher than those in BLM group (P<0.05); compared with BLM group, the contents of ALB, ALP, LDH in the treatment groups reduced on 21st day (P<0.05); the expression of GSH in BLM group was increased for feedback regulation and higher than the treatment groups and the sham operation group (P<0.05); (2) some indicators of pulmonary interstitial fibrosis in late stage of IPF:the expressions of HYP, PCⅢ and COL4 were reduced after the treatment. There were significant differences compared with BLM group (P<0.05). ConclusionsTY501 is valuable for the therapy of IPF, the same as the positive drug pirfenidone. TY501 attenuates BLM-induced pulmonary fibrosis,which may be related to the affection of TGF-β pathway and inhibition of MMPs.

Key words:glycyrrhetic acid derivatives; TY501; IPF; bleomycin;TGF-β; MMPs

通訊作者于冰(1973-)，男，副研究員，研究方向：新藥研發(fā)，，Tel:022-23006815，E-mail:yub@tjipr.com; 徐為人(1965-)，男，博士，研究員，研究方向：藥理與藥物設計,,Tel:022-23006815，E-mail：xuwr@tjipr.com

作者簡介：耿艷艷(1994-)，女，碩士生，研究方向：藥理學，E-mail：13512202058@126.com;

基金項目：天津市應用基礎與前沿技術研究計劃(No 13JCZDJC 28500)；天津市應用基礎與前沿技術研究計劃(No 14JCQNJC13000)

收稿日期:2014-10-26,修回日期:2014-12-09

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1978(2015)02-0210-06

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.02.013