喜馬拉雅紅豆杉與曼地亞紅豆杉中紫杉醇和三尖杉寧堿含量比較

徐曉琴，魏鴻雁*，賈曉光，夏提古麗·阿不利孜，馬曉玲，陳剛

(新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所，烏魯木齊830002)

摘要：目的測定并比較維吾爾藥材喜馬拉雅紅豆杉與人工栽培品種曼地亞紅豆杉中紫杉醇和三尖杉寧堿的含量。方法采用RP-HPLC色譜法梯度洗脫，色譜柱為Century SIL C18-EPS柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈-水；流速為1.0 mL·min-1；檢測波長為227 nm；柱溫為30 ℃。結(jié)果紫杉醇回歸方程：Y=2.050 975×107X+5 531.887，線性范圍為0.042～1.69 μg(r=0.999 9) ，平均回收率為98.0%，RSD=0.98%(n=6)；三尖杉寧堿回歸方程Y=1.806 535×107X+3 046.378，線性范圍為0.040～1.6 μg(r=0.999 9)，平均回收率為96.6%，RSD=2.97%(n=6)，喜馬拉雅紅豆杉葉中三尖杉寧堿平均含量高于莖中含量，曼地亞紅豆杉相反；兩者葉中紫杉醇含量高于莖中含量，而曼地亞紅豆杉莖葉中紫杉醇含量并不低于喜馬拉雅紅豆杉。結(jié)論該方法簡便、準確、適用于紅豆杉藥材的質(zhì)量評價。

關(guān)鍵詞：喜馬拉雅紅豆杉；曼地亞紅豆杉；紫杉醇；三尖杉寧堿

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2015.06.007

中圖分類號：R284文獻標志碼：A

作者簡介：徐曉琴，女，助理研究員，碩士

收稿日期：(2015-03-09)

The contents comparison of taxol and cephalomannine betweenTaxuswallichianaZucc. andTaxusmeadia

XU Xiaoqin，WEI Hongyan*， JIA Xiaoguang， Xiat Tiguli ABULIZI，MA Xiaoling,CHEN Gang(Xinjiang Institute of Chinese Traditional Medicine and Ethical Materia Medicine，Urumqi 830002，China)

Abstract:ObjectiveTo determine and compare the contents of taxol and cephalomannine between Taxus wallichiana Zucc.and Taxus meadia by RP-HPLC.Methods The isolation was performed on a Century SIL C18-EPS column (250 mm×4.6 mm，5 μm)， with the mobile phase consisting of acetonitrile-water，the flow rate of 1.0 mL·min-1，detection wavelength of 227 nm. The column temperature was 30 ℃.Results The regression equation of taxol was Y=2.050 975×107X+5 531.887， linear range within 0.042-1.69 μg(r=0.999 9). The average recovery was 98.0%，RSD =0.98%(n=6);the regression equation of cephalomannine was Y=1.806 535×107X+3 046.378 ，linear range within 0.040-1.6 μg(r=0.999 9).The average recovery was 96.6%，RSD=2.97%(n=6).The cephalomannine content in leaves of Taxus wallichiana Zucc was higher than the average content of stem，Taxus meadia； The taxol content in leaves was higher than the content in stem， and the taxol content in Taxus meadia leaf was not lower than that in Taxus wallichiana Zucc. Conclusion The chromatography method is simple， accurate， and it is suitable for the quality evaluation of Taxus.

Key words:TaxuswallichianaZucc.；Taxusmeadia；taxol；cephalomannine

*通信作者：魏鴻雁，女，研究員，碩士

紅豆杉是紅豆杉科(Taxaceae)紅豆杉屬(Taxus)植物的總稱，是中國一級珍稀瀕危保護植物。紅豆杉科共有5屬23種植物[1]，目前我國共有4個種和1個變種，即(T.wallichiana)、 (Taxuswallichi-ann)、 (T.cuspida-ta)、(T.chinensis(Pilger)Rehd.)和 (T.chinensisvar.Mairei)(變種)。曼地亞紅豆杉(T.media)是我國20世紀90年代中期從加拿大引種而來，是我國引種栽培的最廣泛的品種，據(jù)文獻報道，目前除西藏紅豆杉外其余國產(chǎn)品種均有人工種植記錄[2-3]。

西藏紅豆杉為維吾爾醫(yī)臨床習用藥材，又名喜馬拉雅紅豆杉Taxuswallichiana.Zucc.， 藥用部位為干燥枝及葉，在維吾爾藥安胃加瓦日西吾地吐如西片、消食阿米勒努西顆粒等成方制劑中作為原料藥材使用，主要用于消化道疾病和神經(jīng)衰弱等癥[4-6]。目前由于野生喜馬拉雅紅豆杉生長緩慢，資源有限，且屬于瀕危品種，其藥材來源限制了維吾爾醫(yī)藥的發(fā)展，而人工種植的曼地亞紅豆杉目前主要作為觀賞植物，尚未見作為藥用品種的報道。

因此，課題組采用RP-HPLC色譜法對喜馬拉雅紅豆杉與曼地亞紅豆杉植物的莖、葉中活性成分紫杉醇與三尖杉寧堿的含量進行比較，以期為紅豆杉藥材的質(zhì)量評價提供參考，同時為維藥材喜馬拉雅紅豆杉代用品的科學(xué)選擇提供依據(jù)。

1儀器與試藥

1.1儀器Metter AE163電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；電熱鼓風干燥箱烘箱(上海安亭科學(xué)儀器有限公司)；LC-2010CHT型高效液相色譜儀(日本島津公司)；UPT-1-5超純水儀(成都優(yōu)普超純科技有限公司)；KQ5200DA超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2試藥紅豆杉藥材8批，均為市售，由新疆中藥民族藥研究所副研究員王果平鑒定為真品；紫杉醇(C47H51NO14，中國食品藥品檢定研究所，批號100382-201102)；三尖杉寧堿(中國食品藥品檢定研究所，批號100926-201102)；甲醇、乙腈均為色譜純；水為超純水。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件與系統(tǒng)適用性[7-9]色譜柱：大連江申Century SIL C18-EPS柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)；檢測波長為227 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。流動相乙腈(A)-水(B)梯度洗脫，A相隨時間變化：40%(0～30 min)，80%(30～55 min)，40%(55～65 min)，40%(65～75 min)。在此色譜條件下，三尖杉寧堿的保留時間為40.7 min，紫杉醇的保留時間為43.4 min，理論板數(shù)均大于8 000，分離度均大于1.5，拖尾因子在0.95～1.05之間。

2.2溶液配制對照品溶液的制備:取干燥至恒質(zhì)量的三尖杉寧堿和紫杉醇對照品適量，精密稱定，分別加甲醇制成1 mL含80.80 μg的三尖杉寧堿溶液和1 mL含84.88 μg的紫杉醇溶液。

供試品溶液的制備:取紅豆杉藥材粗粉2.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入甲醇20 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率250 W，頻率25 kHz)30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即得。

2.3專屬性考察分別取三尖杉寧堿、紫杉醇對照品溶液和供試品溶液各10 μL進行測定，按相應(yīng)色譜條件測定，結(jié)果見圖1。

2.4線性關(guān)系考察分別精密吸取上述對照品儲備液0.5，5，10，15和20 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積。以峰面積積分值對質(zhì)量濃度(mg·mL-1)進行回歸，得紫杉醇和三尖杉寧堿回歸方程分別為：Y=2.050 975×107X+5 531.887；Y=1.806 535×107X+3 046.378，結(jié)果表明，紫杉醇和三尖杉寧堿的進樣量分別在0.042～1.69 μg(r=0.999 9)和0.040～1.6 μg(r=0.999 9)范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

圖1HPLC圖

A.混合對照品圖；B.供試品圖；1.三尖杉寧堿對照品；2.紫杉醇對照品

Fig.1 HPLC charomatograms

A.mixed reference substances；B.sample；1.cephalomannine；2. taxol

2.5精密度實驗精密吸取對照品溶液，連續(xù)進樣5次，每次10 μL，測定峰面積積分值計算RSD值。結(jié)果三尖杉寧堿峰面積的RSD為0.52%(n=5)，紫杉醇峰面積的RSD為0.44%(n=5)，說明儀器和色譜條件均具有良好的精密度。

2.6穩(wěn)定性取同一批紅豆杉藥材制成供試品溶液，分別于0，2，4，6，8和10 h進樣10 μL，測得三尖杉寧堿的含量依次為0.94，0.94，0.89，0.87，0.84和0.82 mg·g-1，平均值為0.886 mg·g-1，RSD為5.07%；紫杉醇的含量依次為1.00，0.96，0.95，0.95，0.91和0.88 mg·g-1，平均值為0.945 mg·g-1，RSD為4.45%。

2.7重復(fù)性實驗精密稱取同一批樣品5份(每份2.0 g)，按供試品溶液制備項下方法制備溶液及上述色譜條件測定，結(jié)果三尖杉寧堿的平均含量為0.917 mg·g-1，RSD為3.0%，紫杉醇的平均含量為0.988 mg·g-1，RSD為1.89%。測定結(jié)果表明此方法重復(fù)性良好。

2.8回收率實驗精密稱取供試品2.0 g，共6份，分別置于50 mL具塞錐形瓶中，按2.2項下供試品制備方法制備溶液，分別精密吸取供試品溶液2 mL、對照品溶液2 mL，混勻，過濾取續(xù)濾液在含量測定色譜條件下進樣10 μL，計算回收率、結(jié)果、樣品中三尖杉寧堿的平均回收率為96.6%(n=6)，RSD=2.97%。紫杉醇平均回收率為98.0%(n=6)，RSD=0.98%。見表1。

2.9樣品測定取不同批次紅豆杉藥材按2.2方法制備供試品溶液，按2.1色譜條件進樣測定，記錄色譜峰面積積分值，分別計算三尖杉寧堿和紫杉醇的含量，結(jié)果見表2。

表1回收率測定結(jié)果

Tab. 1 Results of recovery test

( n=6)

表2樣品含量測定結(jié)果

Tab.2 Results of the samples content determination

( n=8)

3討論

紅豆杉植物中含有多種紫杉烷類化合物，而這類化合物極性相近，筆者預(yù)實驗中采用甲醇-水、乙腈-水等度洗脫，但分離效果不理想，隨后又采用經(jīng)典的VLC法對紅豆杉藥材氯仿和甲醇提取物中的紫杉烷類化合物進行有效富集，并對其進行定性定量分析。結(jié)果顯示，經(jīng)過硅膠吸附再洗脫，餾分中紫杉醇相對含量有所提高，但是這一結(jié)果并不能真實體現(xiàn)藥材中紫杉醇的含量。因此，筆者通過簡化前期處理步驟，最大限度減少紫杉醇的損失，色譜洗脫方法進而改用梯度洗脫法，從而增大主峰與雜質(zhì)峰的分離度，改善分離效果，實驗結(jié)果顯示，所采用的RP-HPLC色譜條件適用于紅豆杉科植物中紫杉醇化合物的含量分析，并能夠為紅豆杉科植物的質(zhì)量控制提供參考。

穩(wěn)定性實驗測定結(jié)果表明，在考察的10 h范圍內(nèi)，樣品隨時間變化其所含三尖杉寧堿和紫杉醇的相對含量呈逐漸下降趨勢，所以制備的樣品溶液最好臨用新配。

野生品種喜馬拉雅紅豆杉與人工種植品種曼地亞紅豆杉進行比較，由結(jié)果可知喜馬拉雅紅豆杉葉中三尖杉寧堿的平均含量高于莖中的含量，而人工種植的曼地亞紅豆杉葉中三尖杉寧堿結(jié)果與其相反；人工種植的曼地亞紅豆杉莖、葉中紫杉醇含量并不低于野生品種，筆者分析這可能與藥材的生長年限、生長環(huán)境及藥材活性成分在植物體不同藥用部位的累積規(guī)律和采集時間有很大關(guān)系，為有效評價曼地亞紅豆杉的質(zhì)量及科學(xué)尋找野生喜馬拉雅紅豆杉的代用品還有待進一步的研究。

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