《回回藥方》中扎里奴思方對動脈粥樣硬化大鼠核因子-κB、單核細(xì)胞趨化蛋白-1表達(dá)的影響

姜紅李彥明徐勝東1劉敬霞

(寧夏醫(yī)科大學(xué)，寧夏銀川750004)

摘要〔〕目的研究扎里奴思方對動脈粥樣硬化大鼠核因子(NF)-κB、單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)-1表達(dá)的影響并探討其作用機(jī)制。方法對照組喂以實驗鼠SPF級顆粒飼料，實驗鼠喂高脂飼料并以維生素D 315萬U/kg 灌胃1次/w以建模。實驗組分為模型組、辛伐他汀(0.003 g/kg)組、扎里奴思方高劑量組(3.08 g/0.1 kg)、扎里奴思方低劑量組(1.54 g/0.1 kg)。給藥容積為1 ml/0.1 kg,1次/d。用藥周期8 w，觀察血脂代謝總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)及NF-κB、MCP-1等炎癥因子在血管中的表達(dá)情況。結(jié)果血脂指標(biāo)扎里奴思方高劑量組、低劑量組較空白組差異性明顯(P<0.01)；MCP-1在辛伐他汀和扎里奴思方高劑量組陽性表達(dá)明顯減少(P<0.05 or P<0.01)；對照組大鼠主動脈NF-κB表達(dá)較少(P<0.01)，模型組呈強(qiáng)陽性表達(dá)(P<0.05)，給藥組呈中等陽性表達(dá)(P<0.01)。結(jié)論有效量扎里奴思方抑制體內(nèi)的炎癥因子表達(dá)可能為其對動脈粥樣硬化有效的機(jī)制。

關(guān)鍵詞〔〕扎里奴思方；動脈粥樣硬化；NF-κB；MCP-1

中圖分類號〔〕R29〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

基金項目：國家自然科學(xué)基金(No.81260569)

通訊作者：劉敬霞(1970-)，女，博士，副教授，主要從事中醫(yī)藥、回醫(yī)藥防治老年病研究。

1濟(jì)源市婦幼保健院

第一作者：姜紅(1978-),女，碩士，講師，主要從事中醫(yī)學(xué)教學(xué)工作。

《回回藥方》記載了多首芳香活血化瘀藥方，扎里奴思方由安息香、法里公、法忒刺撒里榮、木里葉、撒法郎、牡丹皮、蘆薈、伯思八牙、干祖伐、肉桂、膃肭臍、阿夫忒蒙、石菖蒲組成〔1〕。本課題組的研究〔2，3〕提示扎里奴思方具有減少動脈粥樣硬化斑塊，通過抑制血小板黏附和聚集來抗血栓形成,保護(hù)神經(jīng)元、穩(wěn)定動脈粥樣硬化(AS)斑塊等作用。慢性炎癥反應(yīng)是AS發(fā)生機(jī)制之一是多數(shù)學(xué)者的共識〔4，5〕。本課題組通過研究核因子(NF)-κB、單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)-1在AS組織中表達(dá)的情況，進(jìn)一步豐富扎里奴思方治療AS的機(jī)制。

1材料與方法

1.1藥物扎里奴思方組(安息香3 g、法里公12 g、法忒刺撒里榮12 g、木里葉12 g、撒法郎12 g、牡丹皮12 g、蘆薈12 g、伯思八牙12 g、干祖伐24 g、肉桂12 g、膃肭臍12 g、阿夫忒蒙12 g、石菖蒲12 g)：將草藥研末后待灌胃用，灌胃體積1 ml/0.1 kg。藥材均來自寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬回中醫(yī)院。

1.2實驗動物SD雄性大鼠，普通級，3月齡,60只，體重(300±50)g，均來自寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，均在同一動物房中飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件嚴(yán)格保證符合標(biāo)準(zhǔn)。常規(guī)喂養(yǎng)7 d。

1.3分組及給藥空白對照組大鼠喂以SPF級實驗鼠顆粒飼料。AS模型大鼠的制作方法改進(jìn)版〔6〕：以配方為0.5%膽酸鈉、3%膽固醇、0.12%丙硫氧嘧啶、10%豬油、5%白糖、81.38%基礎(chǔ)飼料的高脂飼料喂養(yǎng)大鼠,每周灌胃315萬U/kg維生素D 1次。造模開始6 w后隨機(jī)處死3只大鼠檢驗造模情況,檢測發(fā)現(xiàn)總膽固醇(TC)異常增高、 主動脈彈性下降、內(nèi)膜增厚、肉眼可見脂質(zhì)斑塊,為造模成功。模型大鼠持續(xù)12 h禁食不禁水，眼眶取血檢測血清中TC，根據(jù)TC隨機(jī)分層將動物分為模型組、辛伐他汀組(0.003 g/kg)、扎里奴思方高劑量組(3.08 g/0.1 kg)、扎里奴思方低劑量組(1.54 g/0.1 kg)。按上述分組灌胃給藥，給藥容積為10 ml/kg,1次/d,連續(xù)給藥8 w。

1.4血脂檢測大鼠禁食不禁水12 h予10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉，將大鼠仰臥固定，頸總動脈取血，靜置離心分離血清，統(tǒng)一批號的試劑測定血清中TC、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)及載脂蛋白(Apo)A1水平。

1.5血管組織中NF-κB、MCP-1的表達(dá)情況處死大鼠后剪取主動脈弓，4%多聚甲醛固定，做成厚度為4 μm的切片。繼續(xù)行SABC法染色并測定大鼠主動脈弓NF-κB、MCP-1的表達(dá)情況，所用抗體為一抗羊抗鼠，二抗IGg。選6個隨機(jī)光學(xué)視野觀察：陰性(-，淺染淡藍(lán)色)，弱陽性(+，有淡黃色顆粒物質(zhì))，中等陽性(，有黃色顆粒物質(zhì))，強(qiáng)陽性(，有棕黃色顆粒物質(zhì))。同一組標(biāo)本中陽性表達(dá)評分，- = 0分；+=1分；=2分；=3分。

1.6統(tǒng)計學(xué)分析組間比較行t檢驗。

2結(jié)果

2.1扎里奴思方對AS大鼠血脂的影響模型大鼠血清中TC、LDL、HDL、AI明顯升高較空白組差異顯著(P<0.01)，給藥組大鼠TC、LDL含量明顯減少，AI降低，HDL略有升高，較模型組差異顯著(P<0.05)。見表1。

2.2血管中MCP-1、NF-κB的表達(dá)情況大鼠主動脈中MCP-1無棕黃色顆粒出現(xiàn)；大量棕黃色顆粒出現(xiàn)在模型組主動脈內(nèi)，呈強(qiáng)陽性表達(dá)，組間比較差異顯著 (P<0.01)。MCP-1在辛伐他汀和扎里奴思方高劑量組陽性表達(dá)減少明顯，低劑量組中陽性表達(dá)有所降低，與模型組比較差異不明顯(P>0.05)?？瞻捉M大鼠主動脈NF-КB表達(dá)，少數(shù)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)淡黃色顆粒；模型組NF-КB表達(dá)呈棕黃色顆粒強(qiáng)陽性，扎里奴思方組NF-КB中等陽性表達(dá)，較模型組差異顯著 (P<0.01)。見表1。

表1　各組大鼠血清中血脂含量及主動脈中NF-κB、MCP-1表達(dá)水平比較

與模型組比較：1)P<0.05，2)P<0.01

3討論

NF-κB為一個轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族，包括5個亞單位：Rel (cRel)、p65 (RelA,NF-κB3)、RelB和p50(NF-κB1)、p52(NF-κB2)。p65 、cRel和RelB分含有N端Rel同源區(qū)(RHD)和C端的反式激活結(jié)構(gòu)域(TD)，在RHD的C末端有一個核定位區(qū)域(NLS)，負(fù)責(zé)與DNA結(jié)合、二聚體化和核易位，而TD則與轉(zhuǎn)錄活化相關(guān)。參與免疫反應(yīng)的早期和炎癥反應(yīng)各階段的許多分子都受NF-κB的調(diào)控，包括腫瘤壞死因子(TNF)-α、白介素(IL)-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、iNOS、環(huán)氧合酶(COX)2、趨化因子、黏附分子、集落刺激因子等，處于各種細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)的中心環(huán)節(jié),活性調(diào)控非常復(fù)雜,激活后可與EC上黏附分子、IL-6、IL-1、IL-8、MCP-1等基因增強(qiáng)子序列中相應(yīng)結(jié)合位點結(jié)合,迅速誘導(dǎo)其基因表達(dá)，使表達(dá)增強(qiáng)〔7〕。MCP-1作為一種趨化因子，在炎癥反應(yīng)中具有重要作用，編碼MCP-1基因的表達(dá)受NF-κB的調(diào)控，單核細(xì)胞中存在著NF-κB的信號通路，是單核細(xì)胞增殖時必經(jīng)的信號通路。《回回藥方》記載了多首芳香活血化瘀藥方，扎里奴思方由安息香、法里公、法忒刺撒里榮、木里葉、撒法郎、牡丹皮、蘆薈、伯思八牙、干祖伐、肉桂、膃肭臍、阿夫忒蒙、石菖蒲組成。有關(guān)扎里奴思方對減少AS斑塊、治療動脈粥樣硬化性腦血管病方面的研究較多，其穩(wěn)定AS斑塊作用基本明確，有臨床和實驗研究證實。本課題組發(fā)現(xiàn)扎里奴思方可以改善模型大鼠血脂紊亂現(xiàn)象,降低TC、LDL、ApoA1，增加HDL,具有良好的治療效果。扎里奴思方能下調(diào)EC中MCP-1的表達(dá)，對NF-κB有抑制其表達(dá)的趨勢。表明扎里奴思方可以通過抑制MCP-1及NF-κB的表達(dá)，減輕EC的損傷。

4參考文獻(xiàn)

1牛陽.回回藥方研究〔M〕.銀川:黃河出版?zhèn)髅郊瘓F(tuán)陽光出版社，2010：238.

2單曉宇.回藥扎里奴思方對腦梗死患者頸動脈硬化的影響〔J〕.寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2010;34(8)：753-6.

3劉敬霞，李建生.扎里奴思方和蜜煎菖蒲方對腦缺血大鼠血栓形成和血小板聚集的影響〔J〕.寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,33(12)：1117-9.

4徐也魯.動脈粥樣硬化——一種慢性炎癥過程〔J〕.中國動脈硬化雜志,2001;9(2):93-5.

5Ross R.Atherosclerosisan inflammatory disease〔J〕.J N Engl Med,1999;340:115-26.

6楊曉玲,趙迅霞,王菲,等.實驗大鼠動脈粥樣硬化模型的建立〔J〕.寧夏醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2007;8(29):350-2.

7Monaco C,Andreakos E,Kiriakidis S,etal.Canonical pathway ofnu-clear factor kappa B activation selectively regulates proinflammatory and pro-thrombotic responses in human atherosclerosis〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,2004;101(15):5634-9.

〔2014-09-11修回〕

(編輯曲莉)