杜秀雅，馬華剛

（1.濰坊醫(yī)學(xué)院，濰坊 261041；2.濰坊市人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，濰坊 261041）

卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程受多因素相互作用、相互影響，多重調(diào)控因子影響其發(fā)育過(guò)程，其中極為重要的是下丘腦-垂體-卵巢軸及促性腺激素，如FSH、LH。FSH 是卵泡發(fā)育必須的激素，其主要生理作用是促進(jìn)竇前卵泡及竇卵泡顆粒細(xì)胞增殖與分化，分泌卵泡液，使卵泡生長(zhǎng)發(fā)育。LH 主要作用是刺激卵泡膜細(xì)胞合成雄激素，主要是雄烯二酮，為E2的合成提供底物。卵泡還受卵巢顆粒細(xì)胞分泌的抑制素、激活素、卵泡抑制素及眾多細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的調(diào)節(jié)如白細(xì)胞介素-1、腫瘤壞死因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子（VEGF）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、成纖維因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、血小板衍生生長(zhǎng)因子，對(duì)下丘腦-垂體-卵巢軸調(diào)節(jié)及通過(guò)其自、旁分泌的作用調(diào)節(jié)卵泡生長(zhǎng)發(fā)育。適當(dāng)?shù)难鯘舛葘?duì)卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育極為重要，研究表明卵巢內(nèi)氧氣濃度較低，其范圍在1.3%～5.5%左右［1］，卵巢內(nèi)環(huán)境為低氧環(huán)境，與低氧有關(guān)的因子有很多，其中最靈敏的當(dāng)屬缺氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）。

HIF-1是缺氧條件下廣泛存在于哺乳動(dòng)物的一種轉(zhuǎn)錄因子，由HIF-1α和HIF-1β組成，其中HIF-1α是主要的氧調(diào)節(jié)亞基，可以調(diào)節(jié)下游靶基因VEGF的轉(zhuǎn)錄促進(jìn)血管新生，對(duì)細(xì)胞適應(yīng)缺氧狀態(tài)至關(guān)重要，缺氧對(duì)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程中染色體分離和復(fù)制有重要影響［2］，本研究從蛋白水平檢測(cè)了促排卵對(duì)小鼠卵巢組織中HIF-1α表達(dá)，旨在研究促排卵過(guò)程中多卵泡同時(shí)發(fā)育對(duì)卵母細(xì)胞氧供的改變及缺氧對(duì)卵母細(xì)胞質(zhì)量的影響。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

清潔級(jí)成年雌性昆明小鼠30只，鼠齡6～8周，體重20～25g，由濰坊醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)階段，自然光照，自由取水和攝食，陰道涂片檢查動(dòng)情周期。隨機(jī)分為2組：自然排卵組（對(duì)照組）、促排卵組（實(shí)驗(yàn)組），每組15只。

二、研究方法

實(shí)驗(yàn)組于動(dòng)情周期第3天腹腔注射促排卵藥普麗康（50U／0.5ml，歐加農(nóng)，荷蘭）0.4U／g，注射后48h頸椎脫臼法處死；對(duì)照組小鼠進(jìn)入動(dòng)情期后（陰道涂片全為無(wú)核角化細(xì)胞，間或有少量上皮細(xì)胞）頸椎脫臼法處死。兩組小鼠處死后取卵巢組織，經(jīng)4%多聚甲醛固定，脫水，常規(guī)石蠟包埋，切片（4 mm），用于免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)小鼠卵巢HIF-1α的表達(dá)及定位。

三、小鼠卵巢組織中HIF-1α 表達(dá)及定位的檢測(cè)

采用辣根過(guò)氧化物酶復(fù)合物（HRP）免疫組織化學(xué)SV（Super Vision）法檢測(cè)HIF-1α在小鼠卵巢中的表達(dá)及定位，操作按試劑盒（武漢博士德公司）說(shuō)明書要求進(jìn)行，將上述切片脫蠟至水，滴加3% 雙氧水，室溫10min 以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液的浴盒內(nèi)，在微波爐內(nèi)加熱（92 ℃～96 ℃）5 min，冷卻至室溫，滴加封閉液，室溫30min以阻斷非特異性的結(jié)合。滴加一抗（山羊抗兔HIF-1α單克隆抗體，武漢博士德公司，1∶100 稀釋），4 ℃過(guò)夜，滴加二抗（多聚體抗山羊IgG-HRP，武漢博士德公司），37 ℃30min，最后用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒（武漢博士德公司）顯色。山羊抗兔HIF-1α單克隆抗體用于檢測(cè)小鼠卵巢組織中HIF-1α無(wú)交叉反應(yīng)，陽(yáng)性顯色為棕黃色。每組以PBS代替一抗進(jìn)行孵育作為陰性對(duì)照。

每組任選15只小鼠卵巢切片，經(jīng)免疫組織化學(xué)染色，在卵泡的細(xì)胞胞漿或包膜中出現(xiàn)棕黃色顆粒，為陽(yáng)性細(xì)胞，應(yīng)用Lecia顯微成像系統(tǒng)，高倍鏡（×400）下隨機(jī)選取10個(gè)視野，應(yīng)用Image-Pro Plus圖文分析系統(tǒng)計(jì)算平均光密度值，采用平均光密度法半定量法比較蛋白的表達(dá)強(qiáng)度。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

平均光密度（AOD）＝累計(jì)光密度（IOD）／area。計(jì)量資料采用（±s）表示，采用t檢驗(yàn)比較兩組間均數(shù)。采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。P 值為雙側(cè)概率，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

結(jié) 果

一、HIF-1α在小鼠卵巢組織中的表達(dá)

HIF-1α蛋白在兩組排卵狀態(tài)下小鼠的卵母細(xì)胞及顆粒細(xì)胞上均有表達(dá)（圖1）。

二、平均光密度法半定量比較HIF-1α蛋白的表達(dá)

實(shí)驗(yàn)組小鼠竇狀卵泡卵母和顆粒細(xì)胞中HIF-1α蛋白AOD 值明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

圖1 各組小鼠卵巢卵泡中HIF-1α的表達(dá) 免疫組織化學(xué)SV 法×100

表1 兩組小鼠卵巢組織HIF-1α蛋白AOD 的比較（±s）

表1 兩組小鼠卵巢組織HIF-1α蛋白AOD 的比較（±s）

注：與對(duì)照組相比較，＊P＜0.05

組 別 樣本量（n）AOD對(duì)照組10 0.149 5±0.034 7實(shí)驗(yàn)組 10 0.192 4±0.026 8＊

討 論

隨著輔助生殖技術(shù)的發(fā)展，促排卵治療應(yīng)用日益廣泛，促排卵導(dǎo)致的多個(gè)卵泡同時(shí)發(fā)育是否會(huì)影響卵母細(xì)胞的質(zhì)量引起了人們的擔(dān)憂。卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程是受多因素相互作用相互影響的，多重調(diào)控因子影響其發(fā)育過(guò)程，極為重要的是下丘腦-垂體-卵巢軸及促性腺激素。卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育還需要適當(dāng)?shù)难鯘舛?，與低氧的卵巢內(nèi)環(huán)境有關(guān)的缺氧誘導(dǎo)因子-1最靈敏。

HIF-1是缺氧條件下廣泛存在于哺乳動(dòng)物的一種轉(zhuǎn)錄因子，由α和β兩個(gè)亞基組成的異源性二聚體。編碼HIF 的基因位于第14號(hào)染色體上，是細(xì)胞適應(yīng)缺氧環(huán)境的主要調(diào)節(jié)因子［2］，可以減輕缺氧導(dǎo)致的損害。HIF-1α可以在一定程度上反應(yīng)氧的濃度，氧濃度越低，HIF-1α水平越高［3］。本研究證明促排卵組小鼠卵巢內(nèi)HIF-1α水平較自然排卵組明顯增高，正常情況下，HIF-1α通過(guò)泛素-蛋白酶體通路降解，HIF-1α通過(guò)識(shí)別并結(jié)合多個(gè)76氨基酸泛素多肽，然后迅速運(yùn)送至26S的蛋白酶體處水解，其半衰期只有數(shù)分鐘［4］。促排卵引起多個(gè)卵泡同時(shí)發(fā)育，卵泡周圍氧濃度降低，卵泡長(zhǎng)期缺氧，HIF-1α產(chǎn)生的保護(hù)性適應(yīng)機(jī)制已不足，導(dǎo)致卵泡中HIF-1α泛素化急劇下降，降解減少，并且在低氧環(huán)境下，HIF-1α和HIF-β形成的二聚體變得更加穩(wěn)定，降解進(jìn)一步減少，最終導(dǎo)致HIF-1α增加［5］。

已經(jīng)有很多文獻(xiàn)表明促排卵可以影響卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育：促排卵影響卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂，對(duì)其表達(dá)修飾過(guò)程及生長(zhǎng)發(fā)育能力均起不良作用［6-7］。不僅如此，促排卵還可導(dǎo)致顆粒細(xì)胞的凋亡［7-8］。促排卵引起卵母細(xì)胞質(zhì)量的變化可能是影響了調(diào)節(jié)其生長(zhǎng)發(fā)育的因子進(jìn)而影響其質(zhì)量。良好的卵母細(xì)胞質(zhì)量是優(yōu)質(zhì)胚胎的前提，卵母細(xì)胞質(zhì)量下降勢(shì)必導(dǎo)致胚胎質(zhì)量下降，促排卵是否會(huì)增加新生兒出生缺陷的發(fā)生仍是人們思考的問(wèn)題。有文獻(xiàn)表明借助IVFET 助孕技術(shù)出生的新生兒先天畸形發(fā)生的概率明顯高于自然妊娠出生的新生兒［9］，促排卵獲得較多的卵母細(xì)胞是IVF-ET 助孕技術(shù)的關(guān)鍵步驟，高水平的促性腺激素增加了卵母細(xì)胞非整倍體形成的風(fēng)險(xiǎn)，增加了后代先天畸形率。

在體外培養(yǎng)中，高濃度氧環(huán)境下生長(zhǎng)的卵泡比在低氧濃度培養(yǎng)發(fā)育的成熟度高［10］。HIF-1α可以在一定程度上反應(yīng)卵泡的質(zhì)量，HIF-1α濃度與卵泡的質(zhì)量成反比［11］。應(yīng)用FSH 促排卵可以上調(diào)HIF-1的表達(dá)，增加HIF-1α的轉(zhuǎn)錄活性［12］。HIF-1α通過(guò)調(diào)節(jié)下游靶基因VEGF 的轉(zhuǎn)錄促進(jìn)血管新生，新生的血管為卵泡提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，氧氣，甾體激素等。多個(gè)卵泡同時(shí)發(fā)育導(dǎo)致單個(gè)卵泡周圍血流量減少，進(jìn)而導(dǎo)致氧濃度降低，影響卵泡的減數(shù)分裂，增加卵母細(xì)胞的非整倍體發(fā)生率。

綜上所述，HIF-1α表達(dá)水平與卵泡質(zhì)量密切相關(guān)，因此可以將HIF-1α表達(dá)水平作為評(píng)價(jià)卵泡質(zhì)量的指標(biāo)。通過(guò)檢測(cè)HIF-1α 水平判斷卵泡的質(zhì)量，并將此應(yīng)用到臨床上來(lái)評(píng)估卵母細(xì)胞質(zhì)量，優(yōu)先選擇質(zhì)量高的卵母細(xì)胞，提高胚胎質(zhì)量，減少促排卵引起的新生兒出生缺陷的發(fā)生率。

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