劉宣宣，王文倩，毛偉平 ，嚴(yán) 浩，孟素芳，王 芳

(1.南京醫(yī)科大學(xué)康達(dá)學(xué)院生理學(xué)教研室，江蘇連云港222000;2.南京師范大學(xué)江蘇省分子醫(yī)學(xué)實驗室，江蘇南京210023)

LC3為微管相關(guān)蛋白1輕鏈3，是酵母 Atg8的同源體［1］。LC3包括 LC3-I和LC3-II，前者是可溶性的，后者結(jié)合于自噬結(jié)構(gòu)膜上。Kabeya等［2］發(fā)現(xiàn)，LC3-II在自噬體和自噬前體的內(nèi)外膜特異表達(dá)，且LC3-II的表達(dá)與自噬結(jié)構(gòu)的形成成正比，因此常用GFP-LC3作為自噬體的標(biāo)志物，觀察活細(xì)胞的自噬活動［3］。哺乳動物自噬蛋白LC3常作為自噬體的標(biāo)記，在4種 LC3同源異構(gòu)體中，LC3B最常被用作標(biāo)記物［4］，因此，筆者對含 GFP-LC3B基因的真核表達(dá)載體的構(gòu)建進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑。逆轉(zhuǎn)錄酶mlV、質(zhì)粒小提試劑盒、DNA膠純化試劑盒、隨機引物(TaKaRa公司)，磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑盒(碧云天公司)。

1.1.2 主要儀器。PE-480型 DNA擴增儀 PCR儀(PE公司)，凝膠圖像分析儀(Vilberlourmat公司)，AB1310全自動DNA測序儀(Perkin-Elmer公司)，Hera Cell 150 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Heraeus公司)。

1.1.3 試驗材料。HEK293細(xì)胞、WRL68細(xì)胞、宿主菌 DH 5α均由南京師范大學(xué)江蘇省分子醫(yī)學(xué)實驗室保存，pcDNA3.1-GFP載體質(zhì)粒由南京醫(yī)科大學(xué)饋贈。

1.2 方法

1.2.1 LC3B基因模板的獲得。Trizol法提取 HEK293細(xì)胞內(nèi)總RNA，mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR反應(yīng)條件:各引物終濃度 0.1 μmol/L，dNTP 各 50 μmol/L，Taq 酶 2 μl，MgCl2115 mmol/L，合計50 μl。PCR擴增程序:94℃預(yù)變性5 min;94℃ 變性45 s，56℃ 退火45 s，72℃ 延伸1 min，30個循環(huán);最后72℃ 延伸10 min。PCR產(chǎn)物放入 －20℃ 冰箱備用。

1.2.2 LC3B基因引物設(shè)計。使用 Primer軟件，根據(jù) Gen Bank公布的人源LC3B基因序列設(shè)計引物，兩端分別引入BamH I和EcoR I酶切位點，并在 BamH I酶切位點后加入Kozak序列。P1上游引物:5'-CGC GGATCC GCCACC ATGCCGTCGGAGAAGACC-3'BamH I;下游引物:5'-CCG GAATTC TTACACTGACAATTTCAT-3'EcoR I。該引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.3 LC3B 基因的擴增和獲得。PCR 反應(yīng)體系(50 μl):P1(20 μmol/L)1 μl，P2(20 μmol/L)1 μl，dNTP Mixture(2.5 mmol/L)4 μl，10 × PCR Buffer 5 μl，模板 cDNA 1 μl，MgCl2(25 mmol/L)3 μl，Taq 酶 0.25 μl，dd H2O 4.75 μl。PCR 反應(yīng)條件:95℃ 預(yù)變性5 min;95℃ 變性30 s，56℃ 退火30 s，72℃ 延伸1 min;30個循環(huán)，最后72℃延伸7 min。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%Agarose電泳鑒定，紫外燈下觀察拍照。

1.2.4 LC3B基因PCR產(chǎn)物純化。回收目的基因，在紫外燈下切下目的條帶，加入DR-I Buffer，均勻混合后75℃ 加熱融化膠塊 6～10 min，加入 1/2 DR-I Buffer體積的 DR-II Buffer，均勻混合。將上清液轉(zhuǎn)移至 Spin Column中，12 000 r/min離心 1 min，棄濾液。加入 500 μl Rinse A，12 000 r/min離心 30 s，棄濾液。加入 700 μl Rinse B，12 000 r/min 離心30 s，棄濾液，重復(fù)1次。將 Spin Column安置于新的1.5 ml EP管中，加入 25 μl滅菌水(加熱到 60℃)，室溫靜置1 min。12 000 r/min離心1 min，洗脫DNA。純化目的片段，進(jìn)行1.5%Agarose電泳鑒定。

1.2.5 基因與 T載體連接并測序。按照 pMD19-T載體試劑盒說明進(jìn)行。取2 μl純化后的 DNA產(chǎn)物與 pMD19-T載體和雙蒸水共5 μl，加入等量 Solution I，16℃ 連接 1 h，取連接混合物10 μl加入到100 μl感受態(tài)細(xì)胞液中，冰浴30 min后42℃ 水浴熱激90 s，立即置冰上，冰浴5 min;每管加入800 μl經(jīng)37℃ 預(yù)熱的 LB液體培養(yǎng)基，37℃ 220 r/min振蕩培養(yǎng)1 h，12 000 r/min離心3 min，棄部分上清，留約200 μl菌液重懸后涂布于含50 μg/ml Kan+的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃正置1 h后，倒置培養(yǎng)過夜。挑選白色克隆株進(jìn)行菌落PCR鑒定，菌液送上海華大基因科技股份有限公司測序。

1.2.6 質(zhì)粒 pcDNA3.1-GFP的提取。質(zhì)粒提取按照 Plasmid Miniprep Kit操作指南進(jìn)行。提取后－20℃ 冰箱保存?zhèn)溆?。所得質(zhì)粒進(jìn)行1.5%Agarose電泳鑒定。

1.2.7 目的基因與載體雙酶切。LC3B目的基因和提取的pcDNA3.1-GFP質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶 BamH I和EcoR I進(jìn)行雙酶切。酶切體系:dd H2O 6 μl，10 × Buffer 2 μl，樣品10 μl，BamH I 1 μl，共 20 μl。酶切反應(yīng)條件:37 ℃，7 h。酶切過后，每管加入6 × Loading Buffer 5 μl終止反應(yīng)，后用1.5%Agarose電泳分離酶切基因與載體，把酶切好的目的基因與載體用DNA凝膠回收試劑盒割膠回收。

1.2.8 目的基因與載體連接。將酶切后的LC3B片段和質(zhì)粒經(jīng)割膠純化后，用T4DNA連接酶連接。連接反應(yīng)體系為(10 μl):dd H2O 3 μl，10 × T4Ligase Buffer 1 μl，LC3B 基因3 μl，pcDNA3.1-GFP 載體 2 μl，10 × T4Ligase 1 μl。連接反應(yīng)條件為:16℃ 水浴，過夜連接14～16 h。

1.2.9 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化。取20 μl連接產(chǎn)物與200 μl制備好的感受態(tài)細(xì)胞混合均勻，冰浴40 min;42℃ 水浴熱激90 s，立即置冰上，冰浴5 min;每管加入800 μl經(jīng)37℃預(yù)熱的LB液體培養(yǎng)基，37℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)1 h，12 000 r/min離心3 min，棄部分上清，留約200 μl菌液重懸后涂布于50 μg/ml Kan+的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃正置1 h后，倒置培養(yǎng)過夜。

1.2.10 陽性克隆的篩選與鑒定。

1.2.10.1 菌落PCR鑒定陽性克隆。隨機挑取單克隆菌落至含 50 μg/ml Kan+的 3 ml LB 液中，37℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。取2 μl菌落進(jìn)行PCR鑒定，PCR體系與條件同“1.2.3”。PCR 產(chǎn)物用1.5%Agarose 電泳鑒定，紫外燈下觀察拍照。

1.2.10.2 雙酶切鑒定陽性克隆。提取質(zhì)粒，用 BamH I和EcoR I進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切體系與條件同“1.2.7”。酶切產(chǎn)物用1.5%Agarose電泳鑒定，紫外燈下觀察拍照。

1.2.11 DNA測序。用 pcDNA3.1質(zhì)粒的通用引物進(jìn)行基因測序，進(jìn)一步確認(rèn)質(zhì)粒構(gòu)建是否成功。

1.2.12 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞檢測自噬。按照磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑盒說明進(jìn)行，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入HEK293細(xì)胞中，在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染基因的表達(dá)。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因擴增結(jié)果 LC3B基因是以從HEK293細(xì)胞中提取RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，通過引物擴增出的，條帶大小約為378 bp(圖1)。條帶1 PCR擴增結(jié)果背景清晰，條帶單一明亮，可基本確定所擴增片段為基因片段LC3B。

2.2 菌落擴增結(jié)果 以菌落為模板，通過引物擴增出LC3B基因，大小約為 378 bp(圖2)。條帶 2、3擴增結(jié)果背景清晰，條帶單一明亮，可以基本確定該菌落為陽性克隆菌。

2.3 雙酶切鑒定結(jié)果 以酶切位點BamH I和EcoR I進(jìn)行雙酶切鑒定后(圖3)，pcDNA3.1-GFP-LC3B雙酶切后有2條帶，上面的條帶大小與條帶2大小相似，且略小，下面的條帶大小約為378 bp，由此可推斷LC3B基因成功插入雙酶切后的 pcDNA3.1-GFP(約 6 170 bp)載體中，即 pcDNA3.1-GFPLC3B重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.4 pcDNA3.1-GFP-LC3B載體測序結(jié)果 將構(gòu)建成功的pcDNA3.1-GFP-LC3B菌液進(jìn)行DNA測序，進(jìn)一步鑒定質(zhì)粒構(gòu)建是否成功。測序結(jié)果顯示，正反兩向引物所擴增出的基因序列與從數(shù)據(jù)庫提取的序列相同，所以確定pcDNA3.1-GFP-LC3B構(gòu)建成功。

2.5 GFP-LC3B質(zhì)粒在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)情況 將GFP-LC3B質(zhì)粒經(jīng)磷酸鈣轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞24 h后，在熒光顯微鏡下觀察(圖4)，由于重組質(zhì)粒帶有GFP基因，在細(xì)胞未發(fā)生自噬時，LC3B表現(xiàn)為LC3B-I，均勻分布于細(xì)胞質(zhì)中，故轉(zhuǎn)染GFP-LC3B質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞中很明顯出現(xiàn)均勻的綠色熒光，證明重組質(zhì)粒GFP-LC3B轉(zhuǎn)染成功。

2.6 鎘誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞和WRL68細(xì)胞的自噬情況 成功轉(zhuǎn)染GFP-LC3B質(zhì)粒后的HEK293細(xì)胞和WRL68細(xì)胞，以10 μmol/L CdCl2誘導(dǎo)處理8 h后，兩細(xì)胞均出現(xiàn)了不同程度的綠色點狀聚集現(xiàn)象，即未發(fā)生自噬時均勻分布于細(xì)胞中的 LC3B-I(18 kDa)在 CdCl2的誘導(dǎo)下向 LC3B-II(16 kDa)轉(zhuǎn)變，即GFP-LC3BI向 GFP-LC3BII轉(zhuǎn)化，而LC3B-II一般只出現(xiàn)在自噬體膜或溶酶體膜上，從而形成集中于自噬體膜或溶酶體膜上的綠色熒光點狀聚集。Dong等［5］發(fā)現(xiàn)低濃度鎘離子(＜10 μmol/L)可以抑制因缺乏小牛血清與堿性成纖維細(xì)胞生長因子而引起的細(xì)胞自噬。此細(xì)胞試驗再次證明pcDNA3.1-GFP-LC3B重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

3 討論

自噬基因LC3B有I型和II型之分。細(xì)胞未發(fā)生自噬時，細(xì)胞內(nèi)合成的 LC3B經(jīng)過加工，成為胞漿可溶性的 I型LC3B，當(dāng)自噬發(fā)生時，I型 LC3B經(jīng)泛素樣加工修飾過程，LC3-I與自噬膜表面的磷脂酰乙醇胺結(jié)合，形成II型LC3B。LC3B-II結(jié)合在胞內(nèi)自噬體的膜上，LC3B-II含量的多少與自噬泡數(shù)量成正比［6－7］。因此LC3B的表達(dá)量與自噬程度密切相關(guān)。

該試驗以Gene Bank公布的人源LC3B的cDNA序列為依據(jù)，在起始密碼子AUG及終止密碼子處設(shè)計引物，并在5'端和3'端分別引入 BamH I和 EcoR I酶切位點，BamH I和EcoR I在LC3B基因序列中不存在，但在pcDNA3.1-GFP質(zhì)粒的多克隆位點處存在，同時在目的基因的5'端ATG前面引入Kozak序列GCCACC后，有助于提高基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯效率。

構(gòu)建克隆載體時選擇T載體，利用T-A克隆，無需使用含限制酶序列的引物，無需優(yōu)化PCR產(chǎn)物，不需做平端處理及添加接頭即可直接進(jìn)行基因克隆，操作方便，成功率高。Xu 等［8］、Lu 等［9］在克隆、測序目的基因時都采用 T-A 克隆。

該研究采用pcDNA3.1-GFP質(zhì)粒，原因是GFP具有以下優(yōu)點:①個GFP個基因片段長度較小(約717 bp)，易于構(gòu)建融合蛋白，且融合蛋白仍能保持熒光激發(fā)活性，可在多種異源生物中表達(dá)且無細(xì)胞毒性，蛋白本身性質(zhì)穩(wěn)定。在熒光顯微鏡下，用波長約490 nm的紫外光激發(fā)后，即可觀察到綠色熒光，直接、簡捷、便于檢測;在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光，說明GFP-LC3B融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)成功。②無需任何作用底物或共作用物，檢測的靈敏度不受反應(yīng)效率的影響，保證了極高的檢測率［10］。

在熒光顯微鏡下觀察到GFP-LC3B會彌散性分布在胞漿內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞自噬時，GFP-LC3B-II表達(dá)在自噬體膜或溶酶體膜上使細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光點狀聚集，為細(xì)胞自噬提供依據(jù)。因此，pcDNA3.1-GFP-LC3B重組質(zhì)粒的成功構(gòu)建為今后研究細(xì)胞自噬提供了一定基礎(chǔ)。

［1］OGATA M，HINO S，SAITO A，et al.Autophagy is activated for cell survival after endoplasmic reticulum stress［J］.Mol Cell Biol，2006，26(24):9220－9231.

［2］KABEYA Y，MIZUSHIMA N，UENO T，et al.LC3，a mammol/Lalian homologue of yeast Atg8，is localized in autophagosome membranes after processing［J］.EMBO J，2000，19(21):57200 －57228.

［3］KOUNO T，MIZUGUCHI M，TANIDA I，et al.Solution structure of microtubule－associated protein light chain 3 and iden－tification of its functional subdomains［J］.J Biol Chem，2005，280(26):24610 －24617.

［4］KLIONSKY DJ，ABELIOVICH H，AGOSTINIS P，et al.Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy in higher eukaryotes［J］.Autophagy，2008，4(2):151 －175.

［5］DONG Z，WANG L，XU J，et al.Promotion of autophagy and inhibition of apoptosis by low concentrations of cadmium in vascular endothelial cells［J］.Toxicol In Vitro，2009，23(1):105 －110.

［6］MIZUSHIMA N.Methods for monitoring autophagy［J］.Int J Biochem Cell Biol，2004，36(12):2491 －2502.

［7］KABEYA Y，MIZUSHIMA N，UENO T，et al.LC3，a mammol/Lalian homologue of yeast Apg8p，is localized in autophagosome membranes after processing［J］.EMBO J，2000，19(21):5720 －5728.

［8］XU X R，ZHANG J B，XIA Z H.Cloning and expression of luffin－a gene from the seeds of Luffa cylindrical［J］.Journal of Zhejiang University Medical Sciences，2005，34(3):207 －216.

［9］LU X X，ZHANG Y，SHAN XN.Cloning and sequencing of Sry gene of muntiacus［J］.Yi Chuan，2003，25(3):299 －301.

［10］CHEN X，WU R，F(xiàn)ENG S，et al.Single cell derived murine embryonic stem cell clones stably express Rex1－specific green fluorescent protein and their differentiation study［J］.Biochem Biophys Res Commol/Lun，2007，362(2):467 －476.