莊汝杰 陳冠軍 莊偉 陳揚(yáng) 童培建
TNF-α、IL-6、IL-8在 Modic I型改變腰椎終板與椎間盤髓核中的表達(dá)及關(guān)系研究
莊汝杰 陳冠軍 莊偉 陳揚(yáng) 童培建
目的 探討腰椎Modic I型改變的腰椎終板與椎間盤髓核中TNF-α、IL-6、IL-8的相關(guān)性。方法收集30例因下腰痛入院手術(shù)治療并行腰椎MRI檢查確認(rèn)為腰椎Modic I型改變患者的術(shù)中病灶椎間盤標(biāo)本,進(jìn)行免疫組化檢測(cè),并觀察椎間盤組織病理變化及炎癥因子的表達(dá),IL-6、IL-8相對(duì)表達(dá)水平以相對(duì)表達(dá)量△Ct或(2-△Ct×104)進(jìn)行分析。結(jié)果Modic I型終板中TNF-α表達(dá)水平(9.2±0.7)高于髓核(7.2±0.5),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);髓核中△Ct IL-6、△Ct IL-8相對(duì)表達(dá)量(6.34±1.82、10.62±1.88)高于終板(4.07±1.86、5.92±1.31),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。結(jié)論Modic I型終板中TNF-α、IL-6、IL-8的表達(dá)水平明顯高于髓核,其引起下腰痛的原因主要為終板的炎癥改變。
Modic I型 炎癥因子 腰椎間盤 終板
腰椎Modic改變是美國(guó)放射科醫(yī)師Modic在20世紀(jì)80年代首先發(fā)現(xiàn)并命名的,現(xiàn)認(rèn)為Modic I型為炎癥水腫期。近年來(lái),筆者共收集30例因下腰痛而行手術(shù)治療的Modic I型患者的病變椎體終板和髓核,檢測(cè)其TNF-α、IL-6、IL-8的表達(dá)水平并探討兩者表達(dá)水平差異的關(guān)系,現(xiàn)報(bào)道如下。
1.1 一般資料 收集2011年6月至2012年12月浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院收治的30例Modic I型改變的慢性下腰痛患者,其中男12例,女18例;年齡43~69歲,平均(54.13±6.35)歲?;颊卟∈?~20個(gè)月,平均(12.32±2.13)個(gè)月;臨床表現(xiàn):右下肢小腿外側(cè)及足背麻木9例,右下肢小腿內(nèi)側(cè)麻木3例,左下肢小腿外側(cè)及足背麻木8例,左下肢小腿內(nèi)側(cè)麻木2例,伴有間歇性跛行8例;影像學(xué)檢查結(jié)果提示病變部位L3~L4節(jié)段12例,L4~L5節(jié)段18例,均為單一節(jié)段病變,且局部存在神經(jīng)壓迫或椎管狹窄;患者腰椎MRI檢查結(jié)果由2位高年資骨科醫(yī)師進(jìn)行獨(dú)立雙盲分析后認(rèn)為屬于腰椎終板變化中的Modic I型改變的患者。手術(shù)采用腰椎后路手術(shù),根據(jù)患者實(shí)際情況選擇融合或非融合。
1.2 方法 手術(shù)取出病變椎體的髓核和終板組織送病理檢查做成石蠟切片,并行TNF-α、IL-6和IL-8免疫組化染色,顯微鏡下觀察結(jié)果:在細(xì)胞質(zhì)或核內(nèi)出現(xiàn)黃、棕色顆粒為陽(yáng)性。免疫組化半定量計(jì)分方法[1]:首先根據(jù)染色強(qiáng)度評(píng)分,0分為無(wú)色,1分為淡黃色,2分為棕黃色,3分為棕褐色。染色深淺需與背景著色相對(duì)比,再將陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分比評(píng)分,0分為陰性,1分為陽(yáng)性細(xì)胞<10%,2分為11%~50%,3分為51%~75%,4分為>75%。染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞百分比的乘積>3分,免疫反應(yīng)(+)。再將手術(shù)時(shí)所采取的椎間盤髓核、終板組織,放入凍存管中,置于-80℃超低溫冰箱中凍存?zhèn)溆?,行?shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)。采用Primer 5.0引物設(shè)計(jì)軟件和引物設(shè)計(jì)原則進(jìn)行PCR引物的設(shè)計(jì),然后由上海生物工程有限公司負(fù)責(zé)合成,序列見表1。cDNA合成操作步驟(可參考TAKARA RT試劑盒):(1)短暫離心后,加入如下組分:5×第一鏈反應(yīng)緩沖液2μ1、Oligo dT引物0.5μl逆轉(zhuǎn)錄酶0.5μl,總RNA 2μl,取DEPC水補(bǔ)齊到10 μl;(2)輕輕混勻后,混合物在37℃中放置20min;(3)85℃加熱15s終止反應(yīng),至冰上進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)或冷凍保存。各個(gè)目的基因的相對(duì)表達(dá)水平以相對(duì)表達(dá)量△Ct或(2-△Ct×104)進(jìn)行分析(注:△Ct數(shù)值大,說(shuō)明組織表達(dá)量反而低)。
表1 GAPDH、IL-6、IL-8、PGE-2引物序列產(chǎn)物及Tm值
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料以表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用q檢驗(yàn)。
ModicⅠ型終板中TNF-α、△Ct IL-6、△Ct IL-8分別為9.2±0.7,4.07±1.86,5.92±1.31,髓核中TNF-α、△Ct IL-6、△Ct IL-8分別為7.2±0.5,6.34±1.82,10.62± 1.88,終板中TNF-α、△Ct IL-6、△Ct IL-8與髓核比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),即終板中的TNF-α、IL-6、IL-8的表達(dá)水平明顯高于髓核。
TNF-α、IL-6、IL-8均屬于炎癥過(guò)程中炎癥介質(zhì)的細(xì)胞因子類。此外,TNF-α亦屬于腫瘤壞死因子超家族成員,是一種主要由激活的巨噬細(xì)胞分泌的能夠抑制成骨細(xì)胞和刺激破骨細(xì)胞作用的炎癥介質(zhì),其在炎癥過(guò)程中發(fā)揮重要作用,通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡,實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞溶解、抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡過(guò)程,且影響多種正常細(xì)胞的生長(zhǎng)分化,并通過(guò)改變內(nèi)皮細(xì)胞基因表達(dá)激活內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生其他炎癥介質(zhì)(如IL-1、IL-6、IL-8、CSF等)。TNF-α參與炎癥反應(yīng)的全部過(guò)程,在炎癥局部血管通透性增加、白細(xì)胞附壁、滲出和致病因子消除等過(guò)程中均起到促進(jìn)作用,TNF-α可引起發(fā)熱、外周血中白細(xì)胞改變等,故有學(xué)者將其稱為“廣譜炎癥介質(zhì)”[2]。許多學(xué)者研究證明,TNF-α水平在腰椎間盤退化癥的患者中較高[3-7]。IL-6、IL-8均屬于主要由單核-巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子,其中IL-6作為一種多效應(yīng)的細(xì)胞因子,對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化甚至基因表達(dá)都有影響,并且作為重要的炎癥遞質(zhì)在退行性骨病發(fā)病中發(fā)揮重要作用,其介導(dǎo)B細(xì)胞的進(jìn)一步分化,刺激肝細(xì)胞合成急性期蛋白,促進(jìn)免疫球蛋白的合成、分泌,增強(qiáng)體液免疫功能,參與炎癥反應(yīng)。此外,IL-6作為炎癥反應(yīng)催化劑,可刺激炎性細(xì)胞聚集、激活和炎性遞質(zhì)的釋放,促進(jìn)腰椎間盤退變的炎癥過(guò)程。IL-8則主要通過(guò)吸引和激活中性粒細(xì)胞,從而導(dǎo)致機(jī)體局部的炎癥反應(yīng)。
本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),ModicI型病變椎體中終板TNF-α的表達(dá)水平明顯高于髓核,終板組織中△Ct IL-6、△Ct IL-8值明顯低于髓核組織,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。相對(duì)表達(dá)量越高,說(shuō)明表達(dá)量反而越低,終板IL-6、IL-8的表達(dá)水平比髓核的更高,表明炎癥在終板中的程度較髓核更為明顯。
本研究結(jié)果明確了終板在Modic I型改變中的重要性,這將對(duì)臨床治療具有指導(dǎo)意義;但是本研究也存在一些不足之處,譬如:由于樣本數(shù)量較少,或許不能全面地、準(zhǔn)確地反映炎癥因子在Modic I型改變中的作用;研究的時(shí)間太短,不能全面地反映出整個(gè)疾病發(fā)展的過(guò)程。今后應(yīng)增加收集的病例數(shù),延長(zhǎng)隨訪,進(jìn)一步亞組分析研究。
[1]許良中,楊文濤.免疫組織化學(xué)反應(yīng)結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)[J].中國(guó)癌癥雜志,1996,6(4):229-231.
[2]Rajasekaran S,Babu J N,Arun R,et al.ISSLS Prize Winner:A Study of Diffusion in Human Lumbar Discs:A Serial Magnetic Resonance Imaging Study Documenting the Influence of the Endplate on Diffusion in Normal and Degenerate Discs[J].Spine, 2004,29(23):2654-2667.
[3]Karchevsky M,Schweitzer M E,Carrino J A.Reactive endplate marrow changes:a systematic morphologic and epidemiologic evaluation[J].Skeletal Radiol,2005,34(3):125-129.
[4]Michael T,Modic M D.Modic Type 1 and Type 2 changes[J].J Neurosurg Spine,2007,6:150-151.
[5]Laurence A G,Marsman,Matthew T.everse transformation of Modic Type 2 changes to Modic Type 1 changes during sustainedchroniclow-backpainseverity[J].JNeurosurgSpine,2007,6: 152-155.
[6]Dominik W,Marco Z,Juerg H,et al.Painful Lumbar Disk Derangement:Relevance of Endplate Abnormalities at MR Imaging [J].Radiology,2001,218:420-427.
[7]Weishaupt D,Zanetti M,Hodler J,et al.Painful lumbar disk derangement:relevanceof endplate abnormalities at MR imaging [J].Radiology,2001,218:420-427.
ObjectiveTo investigate the expression of TNF-α,IL-6 and IL-8 in lumbar vertebral nucleus pulposus and end plate tissue in patients with Modic type I changes.MethodsThirty patients with low back pain and MRI-confirmed lumbar end-plate Modic type I changes underwent surgical treatment.The disc specimens were collected in the surgery and examined with Immunohistochemistry for expression of TNF-α,IL-6 and IL-8.The association of pathological changes of intervertebral disc tissue with the expression of TNF-α,IL-6,IL-8 and the relative expression of Ct or(2-△Ct×104)was analyzed.ResultsThe expression level of TNF-α in lumbar end plates was higher than that in nucleus pulposus(9.2±0.7,7.2±0.5,P<0.05); while the expressions of IL-6 and IL-8 in nucleus was higher than those in end-plate(6.34±1.82,4.07±1.86 and 10.62±1.88, 5.92±1.31,respectively,P<0.05).ConclusionThe expression of inflammatory factors in lumbar endplate were above that of nucleus.The low back pain was caused by the inflammation changes in lumbar end plate.
Modic I type Inflammatory factorLumbar intervertebral disc Lumbar end plate
2014-11-13)
(本文編輯:嚴(yán)瑋雯)
浙江省自然基金資助項(xiàng)目(Y2110746)
310006 杭州,浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨傷科(莊汝杰、陳冠軍、陳揚(yáng)、童培建);杭州市蕭山區(qū)中醫(yī)院骨傷科(莊偉)
莊汝杰,E-mail:rujiezhuang@163.com