姚嵐 梁瑋 劉寶林

(上海理工大學(xué)生物系統(tǒng)熱科學(xué)研究所 上海 200093)

人肝癌細(xì)胞Hep-G2的低溫保存研究

姚嵐 梁瑋 劉寶林

(上海理工大學(xué)生物系統(tǒng)熱科學(xué)研究所 上海 200093)

在細(xì)胞的低溫保存中，低溫保護(hù)劑的種類(lèi)與濃度對(duì)復(fù)溫后的存活率有著重要影響。本文以人肝癌細(xì)胞Hep-G2為研究對(duì)象，利用慢速冷凍法，篩選最佳的凍存液配方。通過(guò)配比不同濃度的甘油、Me2SO以及在Me2SO中添加一定濃度的蔗糖、海藻糖，一周后復(fù)溫細(xì)胞，對(duì)臺(tái)盼藍(lán)染色存活率、MTT存活率以及24 h貼壁率三種檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較分析，結(jié)果表明:以Me2SO作為低溫保護(hù)劑時(shí)，凍存液濃度為10%(v/v)的Me2SO復(fù)溫后細(xì)胞的三種檢測(cè)指標(biāo)最優(yōu)；以甘油作為低溫保護(hù)劑時(shí)，凍存液濃度為20%(v/v)的甘油復(fù)溫后細(xì)胞的三種檢測(cè)指標(biāo)最優(yōu)；再將以上分別得到的最佳濃度(即體積濃度20%甘油、10%Me2SO)與5% Me2SO(v/v)＋0.3 mol/L蔗糖、5%Me2SO(v/v)＋0.3 mol/L海藻糖這四種低溫保護(hù)劑進(jìn)行凍存與比較，5%Me2SO(v/v)＋0.3 mol/L海藻糖檢測(cè)指標(biāo)高于其他實(shí)驗(yàn)組，并且差異顯著(P＜0.05)。最終得到5%Me2SO(v/v)＋0.3 mol/L海藻糖為慢速冷凍保存Hep-G2細(xì)胞的最優(yōu)保護(hù)劑配方。

低溫保存；低溫保護(hù)劑；糖類(lèi)；存活率

隨著人類(lèi)生活環(huán)境的惡化，惡性腫瘤的發(fā)病率越來(lái)越高，腫瘤的早期診斷和治療是目前研究的熱點(diǎn)。而臨床樣本作為研究腫瘤不可再生的寶貴資源，不僅對(duì)于探索新的治療方法，發(fā)現(xiàn)新的診斷工具提供保障，對(duì)于制定新的診斷指標(biāo)以及新藥的研發(fā)也具有重要意義，所以建立腫瘤樣本組織庫(kù)勢(shì)在必行。保持樣本庫(kù)中腫瘤細(xì)胞的活性，可以更加有效地保護(hù)細(xì)胞中蛋白、DNA、RNA等生物信息免受損傷，從而使后續(xù)的腫瘤基礎(chǔ)研究結(jié)果可信、準(zhǔn)確。但是，目前絕大多數(shù)的生物樣本庫(kù)均不能保持細(xì)胞的活性，所以，針對(duì)樣本庫(kù)中各種各樣的細(xì)胞類(lèi)型，研究其細(xì)胞及組織活體的低溫保存方法，具有十分重要的意義。

細(xì)胞的低溫保存有兩種方法:慢速冷卻法與玻璃化保存法[1]，這兩種方法都需要添加低溫保護(hù)劑[2]。而低溫保護(hù)劑的種類(lèi)以及濃度對(duì)細(xì)胞復(fù)溫后的存活率是至關(guān)重要的。自從1949年P(guān)olge C等[3]利用甘油成功的凍存精子后，至今低溫保護(hù)劑的種類(lèi)已達(dá)上百種。由于甘油的局限性，人們繼續(xù)在尋找低溫保護(hù)劑的路上進(jìn)行探索；直到1959年，Lovelock等人發(fā)現(xiàn)了二甲基亞砜(Me2SO)后，人們對(duì)低溫保護(hù)劑的種類(lèi)有了更多的發(fā)現(xiàn)。Jolanta K等[4]利用甘油和羥乙基淀粉來(lái)凍存人體紅細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)羥乙基淀粉比甘油能更有效地保存紅細(xì)胞的血紅蛋白。Chesne C等[5]通過(guò)比較得到，Me2SO較甘油有更好的保護(hù)作用。然而有研究表明Me2SO對(duì)細(xì)胞膜有一定毒副作用，而利用非滲透性保護(hù)劑(如蔗糖，海藻糖等)與滲透性保護(hù)劑Me2SO聯(lián)合應(yīng)用，不僅減小Me2SO的濃度，又能達(dá)到理想的低溫保存效果。Mohammed S等[6]在凍存人體原代肝細(xì)胞時(shí)添加Me2SO與Me2SO＋葡萄糖這兩種保護(hù)劑，兩者對(duì)于復(fù)溫后的存活率沒(méi)有顯著性差異，但通過(guò)檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)得出利用后者保存后的肝功能更佳。目前，腫瘤細(xì)胞的低溫保存也有較多的報(bào)導(dǎo)，Sui L等[7]通過(guò)以人類(lèi)卵巢癌細(xì)胞以及宮頸癌細(xì)胞為研究目標(biāo)，得到海藻糖＋Me2SO的最優(yōu)保護(hù)劑配方。李慧等[8]探討季德勝蛇藥含藥血清對(duì)人肝癌細(xì)胞Hep-G2增殖和凋亡的影響。陳光等[9]利用10% Me2SO＋高濃度血清的凍存液凍存胃腸道腫瘤組織原代細(xì)胞，成功率達(dá)到100%。由以上可以看出，對(duì)于不同種類(lèi)的細(xì)胞，選擇合適的低溫保護(hù)劑，可以更好的保護(hù)細(xì)胞及其功能。

建立肝癌組織樣本庫(kù)，從中篩選肝腫瘤生物標(biāo)志物，利用各種組學(xué)方法來(lái)早期診斷、預(yù)測(cè)肝癌，具有重要意義[10]。因此，本文以人肝癌細(xì)胞Hep-G2為研究對(duì)象，以不同濃度的甘油、Me2SO以及Me2SO聯(lián)合蔗糖、海藻糖作為低溫保護(hù)劑，通過(guò)對(duì)復(fù)溫后細(xì)胞的臺(tái)盼藍(lán)染色存活率、MTT存活率以及24 h貼壁率三種監(jiān)測(cè)指標(biāo)進(jìn)行對(duì)比、顯著性分析等，探討了不同保護(hù)劑對(duì)Hep-G2細(xì)胞的保存效果，優(yōu)化保護(hù)劑配方，從而進(jìn)一步提高低溫保存Hep-G2細(xì)胞的存活率。

1 材料與方法

1·1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)材料:人肝癌細(xì)胞Hep-G2(購(gòu)于中科院)。

實(shí)驗(yàn)試劑:HyClone胎牛血清(賽默飛世爾生物化學(xué)制品北京有限公司)；Dulbecco’s Modified Eagle Medium培養(yǎng)基(DMEM)(GIBCO公司)；臺(tái)盼藍(lán)染色液(2X)，四唑鹽(MTT)(碧云天生物技術(shù)公司)；二甲亞砜(Me2SO)(德國(guó)APPLICHEM公司)；甘油(丙三醇)(BIOSHARP公司)；蔗糖、海藻糖(中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司)。

1·2 儀器與設(shè)備

實(shí)驗(yàn)儀器:二氧化碳培養(yǎng)箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)；超低溫冰箱(青島海爾特種電器有限公司)；低速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng))；程序降溫盒(賽默飛世爾生物化學(xué)制品北京有限公司)。

1·3 方法

1·3·1 細(xì)胞培養(yǎng)

吸除細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基(10%(v/v)胎牛血清＋90%(v/v)DMEM培養(yǎng)基)，加入5 mL的 DHanks液，沖洗細(xì)胞兩次，再加入2 mL的0.25%胰蛋白酶消化，之后于顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞呈現(xiàn)圓粒狀將要分離時(shí)，吸掉胰蛋白酶溶液，加4mL培養(yǎng)基終止消化。反復(fù)吹打瓶壁上殘留的細(xì)胞，并將已消化下來(lái)的細(xì)胞吹打均勻，然后吸入離心管中，1000 r/min離心10 min，吸除上清液，備用。

1·3·2 實(shí)驗(yàn)分組

根據(jù)保護(hù)劑配方種類(lèi)，實(shí)驗(yàn)分為三組，第一組為Me2SO組，對(duì)應(yīng)表1中編號(hào)1～3；第二組為甘油組，保護(hù)劑配方對(duì)應(yīng)表1中編號(hào)4～6，第三組為不同保護(hù)劑組，對(duì)應(yīng)表1中編號(hào)7～10。其中第三組的保護(hù)劑配方是根據(jù)第一、二組實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇Me2SO和丙三醇濃度，再配以蔗糖和海藻糖。將上述配好的凍存液各取3 mL，分別逐滴加入到處理好的細(xì)胞中，輕輕振搖混勻，在室溫下平衡5 min后，再將3 mL細(xì)胞懸液均分三份滴入3支凍存管中，并在各凍存管中標(biāo)注細(xì)胞的組號(hào)。表1中編號(hào)0為對(duì)照組，未加入任何保護(hù)劑。

表1 保護(hù)劑分組Tab·1 The grouPof cryoprotectants

1·3·3 細(xì)胞凍存

將凍存管放入程序降溫盒中，再放入－80℃低溫冰箱中，根據(jù)程序降溫盒的參數(shù)，能實(shí)現(xiàn)的降溫速率為1℃/min。細(xì)胞在－80℃凍存7天。

1·3·4 細(xì)胞復(fù)蘇

一周后從低溫冰箱中取出凍存管，于37℃水浴中快速震蕩復(fù)溫，1000 r/min離心10 min并去除上清液，然后分別加入1mL培養(yǎng)基吹打均勻，制備成細(xì)胞懸液。

1·3·5 細(xì)胞檢測(cè)

1)臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞存活率[11]

凍存前以及復(fù)溫后的細(xì)胞吹打混勻后，取100 uL 于2 mL離心管中，再加入100 uL臺(tái)盼藍(lán)染液染色，混勻后靜止3～5 min，吸取10 uL于血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，分別記錄凍存前以及復(fù)溫后活細(xì)胞和死細(xì)胞數(shù)量。按以下公式計(jì)算細(xì)胞存活率:

細(xì)胞存活率(%)＝

2)MTT檢測(cè)細(xì)胞活性[11]

每組實(shí)驗(yàn)中，取復(fù)溫后的細(xì)胞懸液置于96孔培養(yǎng)板中，每種保護(hù)劑配方有三個(gè)平行，另加一組新鮮對(duì)照組(新鮮細(xì)胞且濃度接近于復(fù)蘇后細(xì)胞)，一組完全培養(yǎng)基組；每孔加入100 uL，每組對(duì)應(yīng)4個(gè)復(fù)孔，即第一、二組實(shí)驗(yàn)共4×14孔，第三組實(shí)驗(yàn)共4×17孔。待細(xì)胞鋪滿(mǎn)孔底后，每孔加入20 uL MTT，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中避光孵育4 h，4000 r/min離心10 min，吸掉上清，每孔加入150 uLMe2SO，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h后，置搖床上低速振蕩10 min，待結(jié)晶物充分溶解后，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD490 nm處測(cè)量各孔的吸光值。按以下公式計(jì)算細(xì)胞存活率:

細(xì)胞存活率(%)＝

3)24 h貼壁率

復(fù)溫后的細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中(500 uL)，加入4.5 mL培養(yǎng)基后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后換液并用D-Hanks液(2.5 mL)清洗兩次，收集上清液，計(jì)數(shù)未貼壁細(xì)胞；接著用胰酶消化后加入培養(yǎng)基，1000 r/min離心10 min，計(jì)數(shù)貼壁細(xì)胞。同時(shí)觀察培養(yǎng)肝細(xì)胞的生長(zhǎng)情況及形態(tài)變化，按以下公式計(jì)算細(xì)胞貼壁率:

24 h貼壁率(%)＝

1·4 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理、統(tǒng)計(jì)以及顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2·1 me2SO組的細(xì)胞存活率、mTT存活率以及24 h貼壁率

凍存前，用臺(tái)盼藍(lán)染色得到細(xì)胞的存活率為(95.74±3)%。

對(duì)照組以及保護(hù)劑濃度(v/v)為5%、10%、15% 的Me2SO的細(xì)胞復(fù)溫后，存活率、MTT存活率以及24 h貼壁率結(jié)果如表2所示。

表2 保護(hù)劑為me2SO組的細(xì)胞復(fù)溫后存活率、MTT存活率以及24 h貼壁率Tab·2 Trypan blue dye exclusion test,MTT assay and the attached rations after 24 h of cellwith me2SO(cryoprotectant)

從表2中可以得出，三個(gè)實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞存活率，MTT存活率以及24 h貼壁率與對(duì)照組(編號(hào)0)相比，均有顯著性差異(P＜0.05)，說(shuō)明加入5%～15%(v/ v)Me2SO的低溫保護(hù)劑能夠顯著提高細(xì)胞的存活率。10%(v/v)Me2SO(編號(hào)2)組的細(xì)胞存活率，MTT存活率以及24 h貼壁率都較5%組高，且均具有顯著性(P＜0.05)；而10%(v/v)Me2SO的MTT存活率以及24 h貼壁率與15%組相比，略高但無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，而細(xì)胞存活率差異有顯著性(P＜0.05)。綜上所述:添加10%(v/v)Me2SO的低溫保護(hù)劑，對(duì)人肝癌細(xì)胞Hep-G2能產(chǎn)生較好的保護(hù)作用。

2·2 甘油組的細(xì)胞存活率、MTT存活率以及24 h貼壁率

凍存前，用臺(tái)盼藍(lán)染色得到細(xì)胞的存活率為(96.66±2)%。對(duì)照組及保護(hù)劑濃度(v/v)為10%、20%、30%的甘油的細(xì)胞復(fù)溫后，細(xì)胞存活率、MTT存活率以及24 h貼壁率結(jié)果如表3所示。

表3 保護(hù)劑為甘油組的細(xì)胞復(fù)溫后存活率、MTT存活率以及24 h貼壁率Tab·3 Trypan blue dye exclusion test,mTT assay and the attached rations after 24 h of cell with glycerol(cryoprotectant)

從表3中可以得出，三個(gè)實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞存活率，MTT存活率以及24 h貼壁率與對(duì)照組(編號(hào)0)相比均有顯著性差異(P＜0.05)，這說(shuō)明加入10%～30% (v/v)甘油的低溫保護(hù)劑能夠顯著提高細(xì)胞的存活率。20%(v/v)甘油(編號(hào)5)組的細(xì)胞存活率，MTT存活率以及24 h貼壁率都較30%(v/v)高，且均具有顯著性(P＜0.05)；而略高于10%組，且無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。綜上所述:添加20%(v/v)甘油的低溫保護(hù)劑的凍存效果與10%(v/v)甘油相近但稍好，對(duì)人肝癌細(xì)胞Hep-G2能產(chǎn)生較好的保護(hù)作用。

2·3 復(fù)方保護(hù)劑組的細(xì)胞存活率、MTT存活率以及24 h貼壁率

從前兩組實(shí)驗(yàn)中分別選擇最優(yōu)保護(hù)劑，從而進(jìn)行第三組復(fù)方保護(hù)機(jī)組實(shí)驗(yàn)。

凍存前，用臺(tái)盼藍(lán)染色得到細(xì)胞的存活率為(95.06±2)%對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組(保護(hù)劑分別為20% (v/v)甘油、10%(v/v)Me2SO、5%(v/v)Me2SO＋0.3 mol/L蔗糖、5%(v/v)Me2SO＋0.3 mol/L海藻糖)的細(xì)胞復(fù)溫后，存活率、MTT存活率以及24 h貼壁率結(jié)果如表4所示。

表4 不同保護(hù)劑的細(xì)胞復(fù)溫后存活率、MTT存活率以及24 h貼壁率Tab·4 Trypan blue dye exclusion test,MTT assay and the attached rations after 24 h of cellwith different cryoprotectant

從表4中可以得出，四個(gè)實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞存活率，MTT存活率以及24 h貼壁率與對(duì)照組(編號(hào)0)相比，均有顯著性差異(P＜0.05)，這說(shuō)明低溫保護(hù)劑對(duì)細(xì)胞的低溫保存有一定作用。

20%(v/v)甘油組(編號(hào)7)無(wú)論是細(xì)胞存活率，MTT存活率以及24 h貼壁率都低于其他三組實(shí)驗(yàn)組，這說(shuō)明在這四種保護(hù)劑凍存細(xì)胞中，20%(v/v)甘油組的凍存效果最差。10%(v/v)Me2SO組(編號(hào)8)，無(wú)論是細(xì)胞存活率，MTT存活率以及24 h貼壁率，都略高于Me2SO＋蔗糖(編號(hào)9)但差異不顯著(P＞0.05)，這說(shuō)明兩組實(shí)驗(yàn)凍存效果接近，但10% (v/v)Me2SO的凍存效果略好于Me2SO＋蔗糖；由此得出:通過(guò)降低Me2SO濃度(v/v)加入蔗糖的低溫保護(hù)劑起到一定的保護(hù)作用，但保護(hù)效果并不如10% (v/v)Me2SO。而10%(v/v)Me2SO(編號(hào)8)，無(wú)論是細(xì)胞存活率，MTT存活率以及24 h貼壁率，都低于Me2SO＋海藻糖(編號(hào)10)，這說(shuō)明Me2SO＋海藻糖的凍存效果優(yōu)于10%(v/v)Me2SO，即Me2SO與海藻糖的聯(lián)合保護(hù)作用優(yōu)于Me2SO的單獨(dú)作用。

3 討論

目前，臺(tái)盼藍(lán)染色法做為最常用的檢測(cè)細(xì)胞死活的方法之一，其原理是喪失活性或是細(xì)胞膜不完整的細(xì)胞由于膜的通透性增加，可被臺(tái)盼藍(lán)染成藍(lán)色；通常認(rèn)為細(xì)胞膜完整性喪失，即可認(rèn)為細(xì)胞已經(jīng)死亡[11]。四唑鹽比色法(MTT)是利用活細(xì)胞線(xiàn)粒體中的琥珀酸脫氫酶可將噻唑藍(lán)(MTT)還原成紫藍(lán)色(Formazan)顆粒的原理，而二甲基亞砜(DMSO)能溶解細(xì)胞中的紫色結(jié)晶物，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，從而間接反映活細(xì)胞數(shù)量[11]。然而，在MTT染色的過(guò)程中有的細(xì)胞雖有細(xì)胞膜的損害，但仍有酶的活性，仍屬于“活細(xì)胞”，不能存活下去；并且臺(tái)盼藍(lán)染色法的誤差偏大。所以這兩種方法聯(lián)合應(yīng)用能更全面地反映細(xì)胞活性[12]。24 h貼壁率是檢測(cè)細(xì)胞復(fù)溫后，在24 h內(nèi)的存活以及貼壁能力的一種方法；與前面兩種方法不同的是，它著重于細(xì)胞復(fù)溫培養(yǎng)后的存活能力。

細(xì)胞在降溫過(guò)程中，胞外溶液會(huì)先結(jié)冰，由于冰晶的形成使細(xì)胞外的溶液濃度增大，導(dǎo)致細(xì)胞脫水收縮，引起細(xì)胞內(nèi)原生質(zhì)和細(xì)胞器的損傷。添加滲透性保護(hù)劑(如甘油、Me2SO等)后，通過(guò)結(jié)合溶液中的水分子從而弱化了水的結(jié)晶過(guò)程，達(dá)到了保護(hù)細(xì)胞的目的。保護(hù)劑濃度的不同以及細(xì)胞膜滲透能力的差異等，都會(huì)影響著細(xì)胞的凍存效果。所以本文通過(guò)前人的實(shí)驗(yàn)總結(jié)，針對(duì)Hep-G2細(xì)胞，篩選出最優(yōu)的低溫保護(hù)劑。

甘油作為最早發(fā)現(xiàn)以及使用的低溫保護(hù)劑[1]，60多年來(lái)仍然被應(yīng)用在細(xì)胞的低溫保存中，而甘油的濃度對(duì)低溫保存效果有著重要的影響。華澤釗等[13]利用濃度為15%(v/v)的甘油凍存表皮細(xì)胞，得到92%的存活率；郝愛(ài)玲等[14]利用濃度為4%(v/ v)的甘油對(duì)鮮精低溫保存的效果達(dá)到最好，由此可見(jiàn)不同的細(xì)胞在低溫保存中對(duì)甘油的濃度要求并不相同。本文選用10%、20%、30%三種常用的甘油低溫保護(hù)劑濃度，研究得到20%(v/v)甘油濃度對(duì)Hep-G2細(xì)胞低溫保存效果最佳。

Me2SO作為滲透型保護(hù)劑，是凍存肝細(xì)胞最常用的保護(hù)劑[15]，常用濃度(v/v)為5%～20%。楊波等[16]利用濃度為10%(v/v)的Me2SO凍存人肝細(xì)胞，存活率達(dá)到89.95%；Andre Guillouzo等[17]通過(guò)配比不同濃度的Me2SO得出:凍存老鼠肝細(xì)胞的Me2SO最佳濃度(v/v)為16%，其他動(dòng)物為14%，而人肝細(xì)胞的Me2SO濃度(v/v)為10%～12%。本文基于前人對(duì)于肝細(xì)胞的研究基礎(chǔ)，選用的Me2SO濃度(v/v)為5%～20%，得到10%(v/v)Me2SO的凍存效果最優(yōu)。

糖類(lèi)作為非滲透型保護(hù)劑，近些年越來(lái)越廣泛的應(yīng)用于低溫保存中。當(dāng)滲透性保護(hù)劑滲入細(xì)胞后，與細(xì)胞內(nèi)的水分子結(jié)合，通過(guò)控制結(jié)晶過(guò)程而達(dá)到保護(hù)作用；而非滲透型低溫保護(hù)劑雖然不能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，但可形成細(xì)胞外的高滲，減少胞內(nèi)冰的形成，雖然兩者機(jī)制不同，合用可以產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，因此目前一致認(rèn)為，非滲透型和滲透型保護(hù)劑混合使用的保護(hù)效果最好。并且有文獻(xiàn)顯示，糖類(lèi)添加到低溫保護(hù)劑中，會(huì)產(chǎn)生更好的保存效果。阿洛糖作為一種罕見(jiàn)的單糖，在某些人類(lèi)細(xì)胞的保存連同Me2SO加入后，復(fù)溫后的存活率有所提高[7]；Me2SO中加入一定濃度的海藻糖可以提高胰島細(xì)胞的存活率[18]；在人肝細(xì)胞的低溫保存中，在保護(hù)劑Me2SO中添加不同濃度的蔗糖與海藻糖，分別得到Me2SO＋蔗糖、Me2SO＋海藻糖的最佳濃度配比[16]。而本文選用蔗糖、海藻糖這兩種常用的糖類(lèi)作為保護(hù)劑添加到Me2SO中，一方面可以通過(guò)降低Me2SO的濃度來(lái)減小對(duì)細(xì)胞的毒性[19]，另一方面利用糖類(lèi)對(duì)細(xì)胞膜的保護(hù)性。與蔗糖相比，海藻糖具有較高的玻璃化溫度、更低的引濕性、并不具有還原性，所以在低溫保護(hù)劑中應(yīng)用更好。因而實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得出濃度為 5%(v/v)Me2SO＋0.3 mol/L海藻糖的凍存效果最佳；雖然濃度為5% (v/v)Me2SO＋0.3 mol/L蔗糖的凍存效果不如濃度為10%(v/v)Me2SO，但兩者差異并不顯著，這說(shuō)明蔗糖仍起到一定的保護(hù)作用。實(shí)際上，海藻糖的濃度將影響保存效果，濃度過(guò)高會(huì)抑制細(xì)胞表面分子(酶等)活性、減少M(fèi)e2SO(滲透型保護(hù)劑)進(jìn)入胞內(nèi)、引起滲透性胞內(nèi)脫水；而濃度過(guò)低起到的作用效果不夠明顯，所以選擇最優(yōu)的海藻糖濃度還有待更多的探討。

4 結(jié)論

本文以人肝癌細(xì)胞Hep-G2為研究對(duì)象，利用慢速冷凍的低溫保存程序，選取了不同濃度的Me2SO、甘油以及一定濃度的Me2SO聯(lián)合蔗糖、海藻糖作為低溫保護(hù)劑，對(duì)比復(fù)溫后細(xì)胞的存活率和24 h貼壁率，結(jié)果表明:添加濃度為5%(v/v)Me2SO＋0.3 mol/L海藻糖的細(xì)胞，復(fù)溫后臺(tái)盼藍(lán)染色存活率、MTT存活率以及24 h貼壁率分別達(dá)到89.88%、92.35%、96.14%，高于其他保護(hù)劑組，并且差異顯著。所以濃度為5%(v/v)Me2SO＋0.3 mol/L海藻糖的保護(hù)劑凍存效果最佳。

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Study on Cryopreservation of Human Hepatoma Hep-G2 Cell

Yao Lan Liang Wei Liu Baolin
(Institute of Biothermal and Technology，University of Shanghai for Science and Technology，Shanghai，200093，China)

It iswell known that the type and concentration of cryoprotectant(CPAs)exertsAsignificant influence on the survival rate of cells following cryopreservation.The optimal cryoprotectant for human hepatoma Hep-G2 cell with slow coolingmethod was determined in the study.The Cells were frozen in Me2SO，glycerol，sucrose and trehalose at different concentration and combination，then stored inA－80℃ freezer for one week.The survival rate was assessed by trypan blue dye exclusion test，MTT assay and 24 h attachment assay. The results suggested that10%(v/v)Me2SO provide effective protection among Me2SO groups；20%(v/v)glycerol provide effective protection among glycerol groups；when sugars were added，5%Me2SO(v/v)＋0.3 mol/L trehalose provide effective protection than the other groups(P＜0.05).In conclusion，5%Me2SO(v/v)＋0.3 mol/L trehalose was the presumptive optimal cryoprotectant for human hepatoma Hep-G2 cell during slow freezing.

cryopreservation；cryoprotectants；sugar；viability

TK124；R318.52

A

0253－4339(2015)02－0095－06

10.3969/j.issn.0253－4339.2015.02.095

簡(jiǎn)介

劉寶林，男，教授，博士，上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，13636524955，E-mail:blliuk＠163.com。研究方向:低溫生物。About the corresponding author

國(guó)家自然科學(xué)基金(51076108)資助項(xiàng)目。(The projectwas supported by the National Natural Science Foundation of China(No. 51076108).)

2014年7月7日

Liu Baolin，male，Ph.D./professor，College of Medical Equipment and Food，University of Shanghai for Science and Technology， ＋86 13636524955，E-mail:blliuk＠163.com.Research fields:cryobiology.