陳 青 王洪榮 葛汝方 崔慧慧 王夢芝 喻禮懷 林 淼

(揚州大學動物科學與技術學院，揚州 225009)

粗料是反芻動物飼糧中重要組成成分，是保證反芻動物生理健康和生產(chǎn)性能的關鍵。飼糧中NDF水平在很大程度上影響瘤胃健康，同時，飼料的物理與化學特性在很大程度上影響動物的咀嚼與反芻時間，從而與瘤胃酸中毒的發(fā)生有一定關系［1］。Menters［2］在 1997 年提出物理有效中性洗滌纖維(physically effective neutral detergent fiber，peNDF)的概念，認為不僅纖維的化學成分在反芻動物飼糧中具有重要性，而且物理性狀也有十分重要的作用。peNDF可維持瘤胃正常功能和動物的健康，維持動物正常的生產(chǎn)性能，為動物提供大量能源，peNDF還可刺激反芻動物的腸黏膜，促進胃腸道的蠕動和糞便的排泄［3］，故peNDF可以作為衡量奶牛健康及生產(chǎn)性能的重要指標。目前，已有眾多學者的研究證明增加飼糧peNDF水平可提高泌乳期奶牛的瘤胃液pH、咀嚼活動和消化率，并影響乳蛋白和乳脂含量［4］。既然飼糧peNDF水平對泌乳奶牛的健康和生產(chǎn)性能有正面影響，那么peNDF水平對后備奶牛是否也有積極影響?因為在奶牛的各個生理階段中，后備奶牛培育期在整個奶牛生產(chǎn)中承上啟下，占著非常重要的地位。提高奶牛的產(chǎn)奶水平，奶牛的營養(yǎng)供給和科學的管理以及環(huán)境因素都很重要，但后備奶牛的培育更為重要［5］。該階段耗費的飼養(yǎng)成本較大，合理培育這階段的后備奶牛，不僅可延長奶牛的生命和使用年限，提高飼料利用率和產(chǎn)奶量，降低養(yǎng)殖成本，還有利于奶牛業(yè)的長期發(fā)展，為高產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)奶牛群的建立奠定基礎［6］。而8～10月齡奶牛是轉入育成期的小育成牛，是母牛性成熟的重要時期［7］，也是轉入育成階段后的生長高峰期［8］，合理培育該階段的母牛可避免過早或過遲進入初情期，為后續(xù)配種和產(chǎn)犢打下基礎。因此研究清楚peNDF水平對8～10月齡后備奶牛的影響可以為培育高品質后備奶牛做出重要貢獻。本試驗通過改變飼糧中粗料羊草的長度來改變peNDF水平，旨在研究不同peNDF水平的飼糧對8～10月齡后備荷斯坦奶牛采食量、瘤胃發(fā)酵參數(shù)和纖維降解菌的影響，為確定8～10月齡荷斯坦奶牛適宜的peNDF需要量提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設計與飼養(yǎng)管理

選取 24頭 8～10月齡體重［(305.88±20.97)kg］接近的健康中國荷斯坦奶牛母牛，隨機分為4組，每組6個重復，每個重復1頭，采用單因子試驗設計，分別飼喂4組不同peNDF水平的飼糧。使用多功能鍘草機(0.4型和40B型，鄭州興達機械有限公司)將各組飼糧中的粗料羊草分別鍘成1、3、5和7 cm 4種理論長度。4組飼糧除羊草長度外其他均無差別。飼糧每天配制，將精料、玉米青貯和羊草混勻以全混合日糧(TMR)形式飼喂。參照 NRC(2001)［9］配制產(chǎn)奶凈能為6.65 MJ/kg和粗蛋白質為15.21%的飼糧。試驗期共70 d，預試期10 d，正試期60 d。奶牛每天飼喂2次(07:00和18:00)，自由采食，自由飲水。定期對牛舍進行消毒。試驗飼糧組成、營養(yǎng)水平及顆粒分布情況見表1。飼糧顆粒分布情況采用賓州粗料分級篩(PSPS)(武漢市科立博器材有限公司)測定，具體操作參照Heinrichs等［10］的方法。

表1 試驗飼糧組成、營養(yǎng)水平及顆粒分布情況(干物質基礎)Table 1 Composition，nutrient levels and particle size distribution of experimental diets(DM basis) %

續(xù)表1

1.2 樣品采集與分析

1.2.1 采食量及平均日增重(ADG)的測定

正試期內(nèi)每周收集飼糧樣品和剩料樣品，置于65℃烘箱中干燥48 h，烘干后粉碎過40目篩，－20℃冰箱保存待測。營養(yǎng)水平測定:飼糧中干物質(DM)、鈣(Ca)、磷(P)和粗灰分含量采用國標法測定(GB/T 6435—1986、GB/T 6436—2002、GB/T 6437—2002和 GB/T 6438—1992);粗蛋白質含量用FOSS-KT260定氮儀測定;中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)含量用ANKOM-A200i型半自動纖維分析儀測定。正試期內(nèi)每15 d于晨飼前測量體重。

1.2.2 瘤胃發(fā)酵參數(shù)和瘤胃菌群結構的測定

正試期的56～58 d每日晨飼后6 h利用口腔瘤胃液采集器(ANSCITECH胃管式瘤胃液采樣器，武漢市科立博器材有限公司)采集瘤胃液200 mL，經(jīng)4層紗布過濾，立即用pHS－3C型pH儀測定瘤胃液pH。過濾后的瘤胃液－80℃保存，用于其他瘤胃發(fā)酵參數(shù)的測定。瘤胃液氨態(tài)氮(NH3-N)濃度采用馮宗慈等［12］的比色法測定。采用氣相色譜法測定揮發(fā)性脂肪酸(VFA)含量［13］。對瘤胃液的纖維降解菌進行定量，瘤胃細菌基因組DNA的提取參照Zhou等［14］的反復凍融法進行，瘤胃細菌定量采用實時定量PCR(RT-PCR)比較閾值法，目的菌相對含量計算采用2－△△Ct法［15］。瘤胃細菌RT-PCR的引物序列見表2。PCR反應體系及和反應參數(shù)參照TIANGEN試劑盒(FP205)說明書進行。

表2 瘤胃細菌RT-PCR的引物序列Table 2 Primer sequences for RT-PCR of rumen bacteria

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)用Excel 2003建立數(shù)據(jù)庫，通過SPSS 19.0軟件中的單因素方差分析對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析和顯著性檢驗，運用LSD法進行多重比較，P ＜0.05為差異顯著，P ＜0.01為差異極顯著，結果以平均值與平均標準誤表示。

2 結果與分析

2.1 不同peNDF水平飼糧對奶牛生產(chǎn)性能的影響

由表3可知，peNDF水平對各組后備奶牛的DM、NDF、ADF采食量和ADG均無顯著影響(P＞0.05)。但可觀察到 ADG隨著 peNDF水平的增加而增加。

表3 不同peNDF水平飼糧對奶牛生產(chǎn)性能的影響Table 3 Effects of different levels of peNDF in diets on performance of heifers kg/d

2.2 不同peNDF水平飼糧對奶牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

由表4可知，各組瘤胃液pH均在6.0以上，pH隨著peNDF水平的增加而增加，并且peNDF1.18為22.73%組的 pH極顯著低于其他3組(P ＜0.01)，peNDF1.18為 23.92% 組極顯著低于peNDF1.18為 25.85% 組(P ＜ 0.01)。peNDF 水平對瘤胃液中總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)濃度、乙酸和丁酸含量的影響不顯著(P＞0.05);丙酸含量總體上隨peNDF水平的增加而減少，peNDF1.18為 22.73%組極顯著高于 peNDF1.18為 23.92% 組(P ＜0.01)、顯 著 高于 peNDF1.18為 28.39% 組(P ＜ 0.05)，peNDF1.18為 25.85% 組 和 peNDF1.18為 28.39%組間差異不顯著(P ＞0.05);peNDF1.18為 23.92%組的乙酸/丙酸極顯著高于 peNDF1.18為22.73%組(P ＜0.01)，并且顯著高于 peNDF1.18為25.85% 組 (P ＜ 0.05)，peNDF1.18為 25.85% 組 和peNDF1.18為28.39% 組間差異不顯著(P ＞ 0.05)。peNDF1.18為25.85%組的 NH3-N 濃度極顯著高于peNDF1.18為 22.73% 組 和 peNDF1.18為 peNDF1.18為 23.92% 組，而且顯著高于 peNDF1.18為 28.39%組(P ＜0.05)，peNDF1.18為 22.73% 、23.92% 、25.85%3組之間差異不顯著(P＞0.05)。

表4 不同peNDF水平飼糧對奶牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響Table 4 Effects of different levels of peNDF in diets on rumen fermentation parameters of heifers

2.3 不同 peNDF水平飼糧對奶牛瘤胃纖維降解菌相對含量的影響

由表 5 可知，試驗以 peNDF1.18為 22.73% 組為對照組，產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的相對含量隨飼糧peNDF水平的增加而增加，黃色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌和溶纖維丁酸弧菌相對含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。peNDF1.18為22.73%組的產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌相對含量極顯著高于另外3組(P＜0.01)，peNDF1.18為 28.39% 組極著高于 peNDF1.18為 23.92%組(P ＜ 0.05)，peNDF1.18為 25.85% 組顯著 高 于 peNDF1.18為 23.92% 組(P ＜ 0.05);peNDF1.18為25.85%組的黃色瘤胃球菌相對含量極顯著高 于 peNDF1.18為 22.73% 組(P ＜ 0.01)并 且顯 著 高 于peNDF1.18為23 .92% 組 和 peNDF1.18為28.39%組(P ＜0.05)，peNDF1.18為 23.92% 組的黃色瘤胃球菌相對含量顯著高于peNDF1.18為22.73%組(P ＜ 0.05);peNDF1.18為 22.73% 組和 peNDF1.18為28.39%組的白色瘤胃球菌相對含量極顯著低于peNDF1.18為 25.85% 組(P ＜0.01)，peNDF1.18為 22.73% 組顯著低于 peNDF1.18為23.92% 組(P ＜ 0.05)，peNDF1.18為 23.92% 組顯著低于 peNDF1.18為25.85%組(P ＜0.05);peNDF1.18為 25.85% 組的溶纖維丁酸弧菌相對含量極顯著高于其他3組(P＜0.01)，peNDF1.18為 22.73% 組顯著低于 peNDF1.18為 23.92%組和 peNDF1.18為28.39% 組(P ＜0.05)，peNDF1.18為 23.92% 組和 peNDF1.18為 28.39% 組差異不顯著(P ＞0.05)。

表5 不同peNDF水平飼糧對奶牛瘤胃纖維降解菌相對含量的影響Table 5 Effects of different levels of peNDF in diets on the relative content of cellulolytic bacteria of heifers

3 討論

3.1 不同peNDF水平飼糧對奶牛生產(chǎn)性能的影響

本試驗中飼糧的粗料長度對DM、NDF和ADF采食量并無顯著影響，該結果與眾多學者試驗結果一致，如 Beauchemin 等［18］和 Yang 等［19］的研究表明，增加peNDF水平不影響DM采食量，但增加飼糧中青貯與干草的比例增加了DM采食量;Yang等［20］的試驗顯示增加粗料長度不影響營養(yǎng)物質攝入量，但增加粗精比降低了DM采食量，Tafaj等［4］通過對25篇文章的Meta分析發(fā)現(xiàn)飼糧中粗料比例大于60%時，DM采食量會受到粗料長度的影響，而比例小于40%時不影響DM采食量，本試驗中，粗料比例未超過60%，所以采食量無顯著變化的結果與之一致;Alende等［21］發(fā)現(xiàn)飼糧中青貯飼料長度不影響DM采食量，但添加小麥秸稈后降低了 DM 采食量;Stojanovic等［22］和Alamouti等［23］的試驗結果顯示粗料與飼糧顆粒大小均不影響DM采食量;由此可見影響營養(yǎng)物質攝入量的主要因素是飼糧中青貯與干草的比例、飼糧粗精比、NDF及粗飼料來源NDF(FNDF)含量、非纖維性碳水化合物(NFC)與NDF比例、粗料種類和粗料品質等，而不是粗料長度或飼糧顆粒長度。此外，Tafaj等［4］還認為飼糧中粗料長度對營養(yǎng)物質攝入量的影響與NDF、FNDF和NFC與NDF比例有交互作用。而在本試驗的試驗飼糧中，除粗料長度不同外，其他飼糧因素均無差別，因此各組的DM、NDF和ADF采食量并未顯示顯著差異。

本試驗中，ADG隨著peNDF水平的增加而增加。后備奶牛ADG過低和過高都會造成不利影響，后備奶牛ADG過低，會造成達到配種年齡時體重過小，從而使發(fā)情周期推遲;ADG過高會使奶牛因體脂肪貯存而過肥，母牛發(fā)情配種不易受胎，成年后產(chǎn)犢時發(fā)生難產(chǎn)［8］。刁其玉［6］推薦養(yǎng)殖場后備奶牛的最佳生長速度控制在800 g/d，本試驗中 peNDF1.18為 25.85% 組和 peNDF1.18為 28.39%組的 ADG分別是0.88和 0.97 kg/d，均達到了800 g/d以上，但 peNDF1.18為 28.39% 組的 ADG過高，故 peNDF1.18為 25.85%組的 ADG 較適宜。

3.2 不同peNDF水平飼糧對奶牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

本試驗中，瘤胃液pH隨著peNDF水平的增加而增加，該結果與其他學者研究結果一致。Beauchemin等［18］的試驗顯示用切割的干草代替粉碎的干草提高了瘤胃液pH，增加了pH大于6.2的持續(xù)時間，減少了pH小于5.8的持續(xù)時間，而且改變飼糧peNDF對pH的影響大于改變青貯與干草比例對pH的影響。Yang等［24］發(fā)現(xiàn)增加青貯苜蓿的長度提高了瘤胃液pH，peNDF8.0與平均瘤胃液pH呈正相關，與pH小于5.8或5.5的持續(xù)時間呈負相關。Zhao等［25－26］認為增加飼糧中稻草或苜蓿干草的長度，顯著增加了瘤胃液pH;增加飼糧peDNF，反芻和總咀嚼時間線性增加，導致pH小于5.8的持續(xù)時間減少。瘤胃液pH是食糜中VFA與唾液中緩沖鹽相互作用以及瘤胃上皮對VFA吸收及隨食糜流出等因素綜合作用的結果;瘤胃液pH主要受飼糧精粗比、采食與反芻時間的影響［27］。本試驗中，4組飼糧精粗比相同，而咀嚼活動的增加使唾液分泌加強，從而更好地緩沖和中和瘤胃中的VFA，導致pH上升。

飼糧peNDF水平對瘤胃VFA的影響在眾學者間尚存在爭議，Zhao 等［25］、Zebeli等［28］認為增加飼糧中苜蓿干草或者青貯玉米的長度不影響VFA的含量，而Beauchemin等［29］認為增加粗料長度降低了 VFA 含量;Beauchemin等［29］、Kononoff等［30］和賀鳴［31］認為增加飼糧中粗料長度增加了乙酸/丙酸，而 Zebeli等［28］的試驗結果與之相反，他認為增加飼糧中青貯玉米的長度降低了乙酸/丙酸。這種差異的出現(xiàn)可能是在各個學者的試驗中，組的粗料長度不一致、國內(nèi)外飼糧配方原料品質的差異以及動物個體的差異造成的。本試驗中，TVFA濃度雖然沒有顯著差異，但是可以觀察到隨著羊草長度的增加先下降后上升的過程。影響瘤胃發(fā)酵、VFA產(chǎn)生量和比例的因素有飼糧的類型、不同種類的碳水化合物飼料原料來源、碳水化合物的加工處理技術、瘤胃環(huán)境和添加劑［27］。本試驗中各組飼糧類型、碳水化合物原料來源和飼糧添加劑完全相同，所以飼糧的加工處理和瘤胃環(huán)境成為影響影響瘤胃發(fā)酵、VFA產(chǎn)生量和比例的主導因素，最短長度粗料組TVFA濃度較高可能是因為切短的粗料增加了可供瘤胃微生物利用的接觸面積，使得飼糧快速發(fā)酵產(chǎn)生大量VFA，而較長的粗料組表現(xiàn)高TVFA濃度的原因可能是長粗料增加了其在瘤胃中的滯留時間，讓飼糧得到更充分的發(fā)酵從而增加TVFA濃度，而且粗料長度的增加使食糜尺寸增加，導致食糜團中VFA的周轉率下降造成VFA的積累［32］。

本試驗發(fā)現(xiàn)，飼糧peNDF水平的增加對乙酸和丁酸含量無顯著影響，但能顯著降低丙酸含量。乙酸含量雖無顯著差異，但有一個隨著粗料長度的增加而先增加后下降的過程，原因是纖維類碳水化合物在瘤胃中降解產(chǎn)生乙酸。粗料長度的增加會降低淀粉在瘤胃中的消化率［19，26］，從而降低了其降解產(chǎn)物丙酸的產(chǎn)生。乙酸/丙酸總體上隨著peNDF水平的增加而增加，其變化趨勢與丙酸含量的變化正好相反，是因為乙酸含量無顯著變化而丙酸含量顯著增加造成的。

本試驗結果顯示瘤胃液NH3-N濃度隨著peNDF水平的增加而增加，該結果與賀鳴［31］的試驗結果一致。瘤胃中NH3-N濃度受采食量、瘤胃外流速度以及飼糧中蛋白質種類、含量和溶解度的影響，本試驗中，4組的采食量以及飼糧中蛋白質種類、含量和溶解度均無差別，所以瘤胃外流速度是影響瘤胃NH3-N濃度的主要因素，增加粗料長度增加了飼料在瘤胃中滯留發(fā)酵的時間，降低了外流速度，蛋白質消化率增加，瘤胃中NH3-N的濃度因此升高。

3.3 不同 peNDF水平飼糧對奶牛瘤胃纖維降解菌相對含量的影響

瘤胃中微生物的含量受限于食糜的滯留時間和流速、可溶性底物的供給以及瘤胃環(huán)境［27］。本試驗中，黃色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌和溶纖維丁酸弧菌的相對含量隨著peNDF水平的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。粗料長度的增加，增加了食糜在瘤胃中的滯留時間并降低了外流速度，讓微生物得以充分的降解粗料和增加自身繁殖，造成相對含量的增加。而羊草增加到7 cm時，細菌含量有下降的趨勢，這與瘤胃液pH的變化一致，可能是因為7 cm羊草組pH的下降稍微降低了細菌的活性。產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的相對含量與預想的試驗結果有很大差距，羊草長度從3 cm增加到7 cm時，其相對含量增加，但羊草長度為1 cm時，其相對含量顯著高于其他3組，雖然我們沒有明確的證據(jù)解釋這種結果，但推測其原因有以下2面:一方面，通常理論上認為pH低于6.2時纖維降解菌的活性受到抑制，但產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌在pH剛剛低于6.2時可能仍然具有較高活性，而且切短的粗料增加了細菌與底物的接觸面積，使得產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌對底物降解加速并迅速繁殖;另一方面，纖維降解菌主要附著于飼料顆粒，而本試驗是通過口腔來采集瘤胃液，瘤胃液偏向于液相，沒有完整反映瘤胃微生物的情況。

4 結論

①飼糧中peNDF水平的改變不影響飼糧營養(yǎng)物質的采食量。

②增加飼糧中peNDF水平能夠提高瘤胃液pH。

③適當增加飼糧中peNDF水平可增加瘤胃中纖維降解菌的相對含量。

④ 飼糧 peNDF1.18為25.85%時可獲得最佳ADG，故本試驗中 peNDF1.18為 25.85% 是 8 ～ 10月齡荷斯坦奶牛適宜的peNDF水平。

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