(瓊州學(xué)院 熱帶生物與農(nóng)學(xué)院，海南 三亞572022)

重金屬是一類典型的環(huán)境污染物.環(huán)境中重金屬污染的來源主要是化工、采礦、金屬冶煉及加工、電鍍、輪船制造等行業(yè)，以及農(nóng)用殺蟲劑、生活污水和垃圾滲出液等.對于生物體而言，重金屬包括必須金屬和非必須金屬［1］.鉛(lead，Pb)屬于非必須金屬，不參與有機體的代謝活動，組織內(nèi)含有較低濃度時就能對有機體產(chǎn)生顯著的毒性［2－3］.

近年來，隨著我國工業(yè)的發(fā)展，工業(yè)廢棄物的排放也隨之增加，重金屬污染越來越嚴(yán)重，嚴(yán)重危害著包括人類在內(nèi)的各種生命體的健康與生存.在所有已知重金屬毒性物質(zhì)中，由鉛引起的污染和危害事件數(shù)量很多，如2010年郴州血鉛事件、2009年陜西鳳翔血鉛事件等，從而倍受人們關(guān)注.生物體即便攝入極少量的鉛，都會造成極大的損害.當(dāng)水中鉛含量超過0.16mg/L 時，就會引起大多數(shù)水生生物中毒，當(dāng)人體內(nèi)鉛含量超過0.1mg/L 時，則人體將受到鉛污染的損害.

牡蠣養(yǎng)殖在世界海水養(yǎng)殖中占有重要地位，目前已成為世界上產(chǎn)量最大的海水養(yǎng)殖動物;在我國也被廣泛養(yǎng)殖，是我國四大養(yǎng)殖貝類之一;同時，牡蠣通常能在其軟組織中累積高濃度的重金屬和有機污染物，常被作為環(huán)境污染的指示生物［4－5］.在所有養(yǎng)殖牡蠣中，近江牡蠣屬于半咸水種類，主要分布在我國華南沿海眾多的河口地帶.由于常常受到河流帶來的重金屬等污染物的影響以及環(huán)境的變化，致使近江牡蠣生長速度減緩、免疫力下降等現(xiàn)象發(fā)生.有資料顯示，由于環(huán)境的影響，自1968 至2010 的四十多年間，牡蠣的棲息地范圍縮小了64%，牡蠣的生物量減少了88%［6］.

有關(guān)鉛對海洋生物急性毒性的研究，國內(nèi)外已有很多報道［7－9］，而鉛對近江牡蠣的急性毒性的研究很少.本試驗研究了鉛對近江牡蠣的急性毒性效應(yīng)，為近江牡蠣的健康養(yǎng)殖、棲息地環(huán)境監(jiān)測、防治污染和海洋環(huán)境保護(hù)等提供參考依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

實驗所用的近江牡蠣采自海南昌化，采捕后立即送至試驗場地，洗刷干凈后置于4 ×4 ×1.5 m 的室內(nèi)水泥池內(nèi)暫養(yǎng)7 d.暫養(yǎng)期間采用靜態(tài)換水法，每天換水1 次，養(yǎng)殖用水為過濾海水，水溫27(±1)℃，PH值8.0，鹽度35 ‰，以金藻和青島大扁藻作為餌料，24h 連續(xù)充氧.暫養(yǎng)結(jié)束后，挑選大小均勻的近江牡蠣個體做為受試生物(10.36 ±1.83g/只)，用來進(jìn)行急性毒性試驗.

使用硝酸鉛作為污染物，將硝酸鉛(分析純，恒興化工)配置成10 mg/ml 的母液.按需要稀釋到相應(yīng)的濃度來進(jìn)行投毒試驗.

1.2 實驗方法

參照《國家環(huán)保局化學(xué)品測試準(zhǔn)則》的方法，采用靜態(tài)換水法，進(jìn)行單因子急性毒性試驗.經(jīng)預(yù)試驗確定試驗藥物質(zhì)量濃度范圍(24 h 不引起死亡的最大質(zhì)量濃度和96 h 全部致死的最小質(zhì)量濃度)后，按照等對數(shù)間距設(shè)定5 個濃度組，分別為:40.00 mg/L、56.56 mg/L、79.97 mg/L、113.09 mg/L、160.00 mg/L，另設(shè)1 個對照組，每組均設(shè)置三個平行.試驗在150 L 的塑料桶中進(jìn)行，每桶加試驗溶液100 L，每組放入經(jīng)暫養(yǎng)的近江牡蠣50 只.試驗期間每24 h 更換1 次試液，不喂食，其他飼養(yǎng)管理同暫養(yǎng)期.觀察記錄受試生物中毒癥狀，以及在各濃度梯度下24h、48h、72h、96 h 的死亡數(shù)，并及時清除死亡個體.判斷近江牡蠣死亡的標(biāo)準(zhǔn)是兩片貝殼不能自主閉合、用針刺激其外套膜無反應(yīng)，則認(rèn)定為死亡.

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗終止后，統(tǒng)計各試驗組近江牡蠣的死亡個數(shù)，計算死亡率.半致死濃度(LC50)的計算采用寇氏法［10］，根據(jù)經(jīng)驗公式:安全濃度(SC)=f ×96hLC50，由于Pb2+屬于難分解、積累性強且毒性較大的物質(zhì)，f值取0.01［11］.使用SPSS19.0 進(jìn)行差異顯著性檢驗，并計算回歸方程.

2 結(jié)果與分析

2.1 硝酸鉛對近江牡蠣急性毒性試驗結(jié)果

硝酸鉛對近江牡蠣急性毒性試驗結(jié)果見表1、圖1.近江牡蠣的死亡率隨著鉛濃度的增加和時間的延長而逐漸增大，對照組死亡率為0，40mg/L 組在前48h 內(nèi)死亡率為0，56.56 mg/L 組96h 死亡率為34%，79.97 mg/L 組72h 時約有一半個體死亡，113.09 mg/L 組48h 時約有一半個體死亡，160 mg/L 組72h 時死亡率達(dá)99%以上、96h 時全部死亡，死亡率為100%.

單因子方差分析表明(表1)，24 h 時，對照組(0mg/L)與40mg/L 組和56.56 mg/L 組三組之間互不存在顯著性差異，79.97 mg/L 組與56.56 mg/L 組不存在顯著性差異，113.09 mg/L 組與其它各組均存在顯著性差異(P＜0.05)，160 mg/L 組與其它各組存在顯著性差異;48h 時，對照組(0mg/L)與40mg/L 組之間不存在顯著性差異，但56.56 mg/L 組、79.97 mg/L 組、113.09 mg/L 組、160 mg/L 組相互均存在顯著性差異(P＜0.05);72h 時，對照組(0mg/L)與40mg/L 組之間不存在顯著性差異，但56.56 mg/L 組、79.97 mg/L 組、113.09 mg/L 組、160 mg/L 組均與除本身之外的其它各組存在顯著性差異(P＜0.05);96h 時，參與試驗的各組均與除本身之外的其它各組存在顯著性差異(P＜0.05).綜合來看，隨著時間的延長，硝酸鉛濃度對近江牡蠣死亡率影響的差異性逐漸增大.

圖1 不同硝酸鉛濃度處理組近江牡蠣死亡率隨時間變化規(guī)律

表1 不同濃度硝酸鉛對近江牡蠣急性毒性試驗結(jié)果

2.2 硝酸鉛對近江牡蠣的半致死質(zhì)量濃度與安全濃度

采用寇氏法計算所得硝酸鉛對近江牡蠣96hLC50為69.61 mg/L，安全濃度(SC)=0.01 ×96hLC50=0.70 mg/L;經(jīng)換算可得Pb2+對近江牡蠣96h LC50為43.55 mg/L，安全濃度為0.44 mg/L.

3 討論

本研究結(jié)果顯示，近江牡蠣對低濃度硝酸鉛的中毒反應(yīng)較慢，而對高濃度硝酸鉛的中毒反應(yīng)很迅速，當(dāng)濃度達(dá)到113.09 mg/L 以上時，24h 內(nèi)就出現(xiàn)大量死亡;當(dāng)濃度達(dá)到160 mg/L 時，72h 就接近全部死亡.說明硝酸鉛濃度越大，近江牡蠣的中毒反應(yīng)越迅速.周湖明等［12］研究了近江牡蠣對Pb 的富集動力學(xué)，結(jié)果表明，在一定濃度范圍內(nèi)，Pb 的累積與暴露濃度呈良好的線性關(guān)系，說明近江牡蠣是比較理想的重金屬Pb 污染的指示生物.本研究結(jié)果進(jìn)一步驗證了此觀點.

本研究結(jié)果顯示，鉛對近江牡蠣96h LC50為43.55 mg/L，約為太平洋牡蠣(22.989 mg/L)［13］和菲律賓蛤仔(22.83 mg/L)的2 倍［14］，但僅為泥東風(fēng)螺(141.525 mg/L)的1/3 左右［15］，可見，即使同為底棲貝類，對鉛的耐受力也有所不同，這可能是由于它們在長期進(jìn)化過程中對生活環(huán)境的適應(yīng)造成的.在前面提到的幾種貝類中，近江牡蠣與太平洋牡蠣在分類地位上最接近，同屬于牡蠣屬，生活習(xí)性也接近，但它們的自然分布區(qū)域卻有很大不同，近江牡蠣主要分布于河口附近鹽度較低的內(nèi)灣，這里有大量隨地表徑流而來的有機物質(zhì)和各種重金屬等，并大量淤積，使得重金屬含量較高;而太平洋牡蠣主要分布于遠(yuǎn)離河口的鹽度較高的海區(qū)，這里的海水隨潮汐等運動而產(chǎn)生大量交換，相較于河口區(qū)域，重金屬含量相對較低，從而使近江牡蠣與太平洋牡蠣這兩個親緣關(guān)系很近的物種對鉛的耐受性呈現(xiàn)出很大差別.

半數(shù)致死濃度(LC50)常被用來作為衡量生物對污染物的敏感性以及污染物毒性大小的重要參數(shù)，根據(jù)新化學(xué)物質(zhì)危害評估導(dǎo)則［16］，96h LC50小于1mg/L 的毒物為極高毒性，1－10 mg/L 為高毒，10－100mg/L 為中毒，大于100mg/L 為低毒.根據(jù)上述毒物等級劃分標(biāo)準(zhǔn)，鉛對近江牡蠣屬于中毒物質(zhì).

漁業(yè)用水標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定鉛含量應(yīng)小于等于0.05 mg/L，而本研究結(jié)果表明鉛對近江牡蠣的安全濃度為0.44 mg/L，約為規(guī)定高限的9 倍，說明近江牡蠣對鉛具有很強的耐受性，但從食品安全考慮，近江牡蠣養(yǎng)殖應(yīng)盡量選擇水質(zhì)優(yōu)良的海區(qū).

［1］Martin M.H.，Coughtrey P.J..Biological monitoring of heavy metal Pollution:Land and air［M］.London:Applied Science Publishers of The United Kingdom，1982.

［2］孫翰昌，徐敬明，甘桂云.4 種重金屬對禾花魚胚胎的毒性效應(yīng)［J］.水生態(tài)學(xué)雜志，2013，34(1):92－95.

［3］Rainbow P.S..Biomonitoring of heavy metal availability in the marine environment［J］.Marine Pollution Bulletin，1995，31:183－192.

［4］Hunter C.L.，Stephenson M.D.，Tjeerdema R.S.，et al.Contaminants in oysters in KaneoheBay，Hawai.i［J］.Marine Pollution Bulletin，1995，30:646－654.

［5］Regelo M.F.，Amaral M.C.R.，Pfeiffer W.C..High Zn and Cd accumulation in the oyster Crassostrea rhizophorae，and its relevance as a sentinel species［J］.Marine Pollution Bulletin，2003，46:1354－1358.

［6］Philine S.E.Zu Ermgassen，Mark D.Spalding，Brady Blake，et al.Historical ecology with real numbers:past and present extent and biomass of an imperilled estuarine habitat［J］.Proc Biol Sci，2012，279(1742):3393 –3400.

［7］李建軍，林忠婷，陳小曲，等.四種重金屬離子對諸氏鯔蝦虎魚的單一和聯(lián)合毒性［J］.海洋環(huán)境科學(xué)，2014，33(2):236－241.

［8］趙江沙，曾兆.銅、汞、鉛對渦蟲的急性毒性作用［J］.應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報，2004，10(6):750－753.

［9］吳賢漢，江新霽，張寶錄.幾種重金屬對青島文昌魚毒性及生長的影響［J］.海洋與湖沼，1999，30(6):604－608.

［10］顧兵，張政，李玉萍，等.半數(shù)致死量及其計算方法概述［J］.中國職業(yè)醫(yī)學(xué)，2009，36(6):507－509.

［11］周永欣，章宗涉.水生生物毒性試驗方法［M］.北京:農(nóng)業(yè)出版社，1989:18－19.

［12］周湖明，李長玲，陳康，黃翔鵠.近江牡蠣富集、排出Pb、Cd 的動力學(xué)及其與體內(nèi)金屬硫蛋白的相關(guān)性研究［J］.廣東海洋大學(xué)學(xué)報，2012，32(6):57－65.

［13］高層.重金屬Pb2+和Cu2+對太平洋牡蠣毒性效應(yīng)的比較研究［D］.青島:中國海洋大學(xué)，2012.

［14］劉瓊玉，洪華生，蔡立哲.重金屬鋅、鉛對菲律賓蛤仔的急性毒性試驗［J］.臺灣海峽，1997，16(1):50－54.

［15］林國清.4 種重金屬鹽對泥東風(fēng)螺幼螺的急性毒性試驗［J］.福建農(nóng)業(yè)學(xué)報，2012，27(3):232－236.

［16］國家環(huán)境保護(hù)總局.HJ/T154－2004 新化學(xué)物質(zhì)危害評估導(dǎo)則［S］.北京:中國環(huán)境科學(xué)出版社，2004.