劉樹萍史同新?孫 敏徐敬星李 民姜玉暇

sCTLA－4與早期梅毒血清固定的相關(guān)性

劉樹萍1史同新1?孫 敏1徐敬星2李 民2姜玉暇2

目的: 明確血清可溶性T細(xì)胞相關(guān)抗原－4(sCTLA－4)與早期梅毒血清固定的相關(guān)性。方法: ELISA檢測60例早期梅毒血清固定患者、20例早期梅毒治療后血清學(xué)轉(zhuǎn)陰患者及20名健康志愿者血清中sCTLA－4水平；同時(shí)對血清固定患者sCTLA－4水平與RPR滴度及臨床分期進(jìn)行相關(guān)分析。結(jié)果: 早期梅毒血清固定患者外周血sCTLA－4水平明顯高于血清學(xué)轉(zhuǎn)陰組及健康志愿者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。血清sCTLA－4水平與血清RPR固定滴度及臨床分期無相關(guān)性(P＞0.05)。結(jié)論: 血清sCTLA－4表達(dá)水平增高可能與早期梅毒血清固定相關(guān)。

梅毒； 血清固定； 可溶性細(xì)胞毒T細(xì)胞相關(guān)抗原－4

梅毒是一種性傳播疾病，多數(shù)患者經(jīng)正規(guī)驅(qū)梅治療后非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)在一定時(shí)間內(nèi)轉(zhuǎn)陰，但仍有15.00%～34.02%1的梅毒患者治療后該類試驗(yàn)維持在某一水平不變而形成血清固定(sero－resistance)。2，3發(fā)生血清固定的具體機(jī)制目前尚不明確。免疫學(xué)研究表明，血清固定患者存在免疫失衡和細(xì)胞免疫抑制。4細(xì)胞毒T細(xì)胞相關(guān)抗原－4(cytotoxic T－lymphocyte associated antigen 4，CTLA－4)具有抗炎和免疫抑制作用，5sCTLA－4是其可溶性形式，它同樣是CTLA－4基因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物，其生物學(xué)活性同CTLA－4，6尚未見其在梅毒血清固定中作用的研究。因此，本實(shí)驗(yàn)通過對梅毒血清固定患者的血清sCTLA－4水平的檢測，初步了解其在梅毒血清固定形成中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料 收集2013年5月至2014年6月于本院、青島市皮膚病防治院及青島市市立醫(yī)院就診的梅毒血清固定患者60例。其中男33例，女27例；年齡20～54歲，平均34.22±8.88歲；一期梅毒19例，二期梅毒41例。陰轉(zhuǎn)組為經(jīng)正規(guī)驅(qū)梅治療后血清學(xué)轉(zhuǎn)陰患者共20例，男12例，女8例。平均年齡36.45 ±8.25歲。其中，一期梅毒9例，二期梅毒11例。對照組為本院及青島市市立醫(yī)院查體中心20名健康志愿者。所有觀察對象均排除HIV感染。3組觀察對象在年齡及性別上均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。入選標(biāo)準(zhǔn):7，8早期梅毒患者；治療后6個(gè)月以上RPR及TRUST試驗(yàn)檢測均陽性；RPR滴度1∶1～1∶8。血清固定后經(jīng)過2～4個(gè)規(guī)范療程的復(fù)治。所有研究對象均無神經(jīng)系統(tǒng)的臨床癥狀及體征，且腦脊液生化及常規(guī)正常，腦脊

液RPR及TRUST檢測均為陰性，排除神經(jīng)梅毒。排除標(biāo)準(zhǔn):9－12惡性腫瘤患者，SLE、Graves病等自身免疫性疾病患者，合并其他感染性疾病及性傳播疾病患者，近期有不潔性行為者。

1.1.2 標(biāo)本 抽取患者及健康對照者空腹血3 mL置于不含熱源和內(nèi)毒素的試管中，操作過程中避免任何細(xì)胞刺激，3000 r/min離心10 min，將血清小心分離后保存于－20℃冰箱內(nèi)待測。

1.1.3 試劑 人共刺激分子CTLA－4(CD152)ELISA檢測試劑盒(北京諾亞杰公司提供，為進(jìn)口分裝產(chǎn)品)；RPR及TRUST檢測試劑盒(上海榮盛生物藥業(yè)有限公司)。

1.2 方法 sCTLA－4的檢測采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA法)進(jìn)行檢測。檢測范圍3.12 ng/mL～100 ng/mL。實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按說明書進(jìn)行。操作結(jié)束后15 min內(nèi)于450 nm波長測吸光度(OD值)，并根據(jù)線形曲線方程計(jì)算sCTLA－4濃度，用酶標(biāo)儀(Rayto RT－6000，深圳雷社生命科學(xué)股份有限公司)直接打印結(jié)果。RPR檢測由青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科按照說明書完成。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS 17.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。不同組別間sCTLA－4水平比較以 ˉx±s表示，采用單因素ANOVA檢驗(yàn)，若差異具有顯著性則進(jìn)一步行LSD檢驗(yàn)作組間兩兩比較；對血清固定患者按其臨床相關(guān)因素分類的sCTLA－4水平比較以中位數(shù)及四分位數(shù)間距表示，采用秩和檢驗(yàn)(Kruskal－Wallis檢驗(yàn)或Mann－Whitney U檢驗(yàn))。P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組別外周血sCTLA－4水平比較 3組外周血sCTLA－4水平之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。進(jìn)一步行LSD檢驗(yàn)兩兩比較，梅毒血清固定組與梅毒血清學(xué)試驗(yàn)陰轉(zhuǎn)組及健康對照組外周血sCTLA－4水平有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。而梅毒治療后血清學(xué)陰轉(zhuǎn)組和健康對照組之間外周血sCTLA－4水平無顯著性差異(P＞0.05)。見表1。

表1 3組觀察對象血清sCTLA－4測定結(jié)果

2.2 血清固定組外周血sCTLA－4水平與臨床相關(guān)性的比較 將梅毒血清固定組外周血sCTLA－4水平與患者性別因素、血清固定滴度以及臨床分期進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表2。

表2 血清固定患者血sCTLA－4水平與臨床參數(shù)比較

3 討論

目前國內(nèi)外對于梅毒出現(xiàn)血清固定的具體時(shí)間尚無統(tǒng)一判定標(biāo)準(zhǔn)。為符合梅毒治療的早期足量規(guī)范的原則，而定義在早期梅毒6個(gè)月、晚期梅毒12個(gè)月較為合理。13臨床上血清固定發(fā)生率較高，患者容易出現(xiàn)情緒障礙，嚴(yán)重影響其生活質(zhì)量。14因此探討梅毒血清固定形成的原因有重要的臨床意義，它將有助于臨床醫(yī)生更好的掌握梅毒的治療，減少梅毒血清固定的產(chǎn)生。

目前，對于梅毒血清固定形成機(jī)制的研究眾多，其中的免疫學(xué)因素15－17是目前研究的熱點(diǎn)，尤其是T細(xì)胞免疫在梅毒血清固定中的作用研究。國內(nèi)外數(shù)個(gè)基于不同研究對象的細(xì)胞免疫學(xué)研究表明，梅毒血清固定患者有嚴(yán)重的Th1/Th2免疫失衡和細(xì)胞免疫抑制。有研究發(fā)現(xiàn)梅毒血清固定患者較健康人和驅(qū)梅治療后血清學(xué)轉(zhuǎn)陰者調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例升高，IL－6、IFN－γ水平降低，而IL－10水平升高。18與健康人相比，血清固定患者外周血淋巴細(xì)胞中Treg細(xì)胞比例及其轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的表達(dá)升高，而Th17細(xì)胞比例及其轉(zhuǎn)錄因子ROR－γt的表達(dá)降低，19進(jìn)一步證實(shí)了血清固定患者存在細(xì)胞免疫抑制。

CTLA－4屬于免疫球蛋白超家族，它通過下調(diào)T細(xì)胞的功能而達(dá)到抑制免疫的作用。其具體作用機(jī)制有如下研究和假說20－23:(1)可介導(dǎo)不依賴Fas途徑的T細(xì)胞凋亡。(2)促進(jìn)TGF－β產(chǎn)生，抑制IL－2的分泌及細(xì)胞由G0/G1期向S期的轉(zhuǎn)化從而抑制T細(xì)胞的功能。(3)與CD28競爭性結(jié)合B7而阻斷共刺激信號的傳遞，從而抑制T細(xì)胞的功能及活化。(4)促進(jìn)酪氨酸SHP－2與TCR/CD3ζ結(jié)合，使 TCRP/ CD3ζ復(fù)合物脫磷酸，從而使TCR不能傳遞T細(xì)胞活化信號，抑制T細(xì)胞的活化。綜上可見CTLA－4在細(xì)胞免疫中的重要地位。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，梅毒血清固定患者血清中sCTLA－4的水平明顯高于血清學(xué)轉(zhuǎn)陰組及健康人群，同

時(shí)血清學(xué)陰轉(zhuǎn)組水平與健康人群無明顯差異性，說明CTLA－4的免疫抑制作用可能在梅毒血清固定的形成中起到某些影響。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)血清中sCTLA－4的水平與患者的性別、血清固定的滴度、臨床分期無明顯相關(guān)。

總之，sCTLA－4可能參與了梅毒血清固定的形成，但是本研究樣本量較少，對結(jié)果的分析可能產(chǎn)生誤差，有待進(jìn)一步的臨床研究證實(shí)。

1 Lin LR，Tong ML，F(xiàn)u ZG，et al.Evaluation of a colloidal gold immunochromatography assay in the detection of treponema pallidum specific igm antibody in syphilis serofast reaction patients: A serologicmarker for the relapse and infection of syphilis.Diagn Microbiol Infect Dise，2011，70(1):10－16.

2楊文林，楊健，黃新宇，等.近10年梅毒血清固定患者臨床分析.臨床皮膚科雜志，2005，34(1):719－721.

3鄭和國，謝小玲，郭恩德，等.梅毒血清固定患者36例臨床分析.中國皮膚性病學(xué)雜志，2008，22(12):735－736.

4凌昕，劉潤秋，施辛，等.梅毒血清固定與神經(jīng)梅毒患者淋巴細(xì)胞亞群的檢測.中國皮膚性病學(xué)雜志，2010，24(5):418－420.

5袁岸龍，夏冰，黃梅芳.CTLA－4的免疫學(xué)作用與疾病.武漢大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2003，24(1):90－93.

6Ostrov DA，ShiW，Schwartz JC，etal.Structure ofmurine CTLA－4 and its role inmodulating T cell responsiveness.Science，2000，290(5492):816－819.

7龍振華.梅毒病學(xué).北京:北京科學(xué)技術(shù)出版社，2004.57.

8謝海莉，趙進(jìn)，李偉，等.梅毒血清固定患者外周血白細(xì)胞介素水平的檢測.中國皮膚性病學(xué)雜志，2013，27(5):486－501.

9 Erfani N，Razmkhah M，Ghaderi A.Circulating soluble CTLA4 (sCTLA4)is elevated in patientswith breast cancer.Cancer Invest，2010，28(8):828－832.

10杜憲紅，邢召全，焦晉山.血清可溶性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原－4在胃癌早期診斷中價(jià)值.中華實(shí)用診斷與治療雜志，2013，27(4):336－338.

11Wong CK，Lun SW，Ko FW，et al.Increased expression of plasma and cell surface co－stimulatory molecules CTLA－4， CD28 and CD86 in adult patientswith allergic asthma.Clin Exp Immunol，2005，141(1):122－129.

12彭文麗，畢小云.血清可溶性共刺激因子CTLA－4和CD28在乙型肝炎患者血清中的表達(dá)及意義.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，35(1):82－84.

13段逸群，張偉明.梅毒“血清固定”及對策.皮膚病與性病，2012，34(4):196－199.

14陳玲玲，季孫平，施辛，等.梅毒血清固定患者抑郁情緒調(diào)查和生活質(zhì)量評估.中國皮膚性病學(xué)雜志，2011，25(7):544－546.

15 Shetsiruli LT，Gogebashvili NV，Toniia KS.Immunologic aspects of thepathogenesis of latent and seroresistant forms of syphilis.Vestn Dermatol Venerol，1988，5:55－58.

16 Podwinska J，Lusiak M，Zaba R，et al.The pattern and level of cytokines secreted by Th1 and Th2 lymphocytes of syphilitic patients correlate to the progression of the disease.FEMS Immunol Med Microbiol，2000，28(1):1－14.

17Salazar JC，Hazlett KRO，Radolf JD.The immune response to infection with Treponema pallidum，the stealth pathogen.Microbes Infect，2002，4(11):1133－1140.

18林雁嘉，林明恩，鄭道城，等.梅毒血清固定與外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及血清IL－6、IL－10、IFN－γ的關(guān)系探討.中國皮膚性病學(xué)雜志，2012，26(3):200－202.

19趙建斌，張明海，馬杰，等.梅毒血清固定患者外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞/Th17細(xì)胞平衡的研究.中華皮膚科雜志，2012，45 (5):347－349.

20 Scheipers P，Reiser H.Fas－independent death of activated CD4＋T lymphocytes induced by CTLA－4 crosslinking.Proc Nati Acad Sci USA，1998，95(17):10083－10088.

21Walunas TL，Bakker CY，Bluestone JA.CTLA－4 ligation blocks CD28－dependent T cell activation.Exp Med，1996，183 (6):2541－2550.

22Waterhoues P，Penninger JM，Timms E，et al.Lymphoproliferative disorderswith early lethality inm ice deficient in Ctla－4. Science，1995，270(5238):985－988.

23Chikuma S，Imboden JB，Bluestone JA.Negative regulation of T cell receptor－lipid raft interaction by cytotoxic T lymphocyteassociated antigen 4.Exp Med，2003，197(1):129－135.

(收稿:2014－11－13 修回:2014－12－12)

Correlation between the level of sCTLA－4 and seroresistance in the patientswith early syphilis

LIU Shu－ping，SHITong－xin，SUNMin，etal.The Affiliated Hospital ofMedical College Qingdao University，Qingdao，266003

Objective:To determine the correlation between soluble cytotoxic T lymphocyte associated antigen－4(sCTLA－4)and seroresistance in the patientswith early syphilis.M ethods:The serum level of sCTLA－4 wasmeasured by ELISA in 60 seroresistance syphilis patients，20 syphilis patientswhose antibodies in the sera were negativity after treatment and 20 healthy controls.The correlation between the level of sCTLA－4 and the RPR titers and the stage of syphilis were analyzed among the non－seroresistance patients after treatment.Results:The level of sCTLA－4 in seroresistance group was significantly higher than that in other two groups(P＜0.05).Therewas no correlation between the level of sCTLA－4 and the RPR titers and the stage of syphilis(P＞0.05).Conclusion:The sCTLA－4may relate to the developmentofseroresistance in the patients with early syphilis.

syphilis；seroresistance；sCTLA－4

山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號:ZR2010HM113)

1青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東青島，266003 2青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬青島市市立醫(yī)院皮膚科，山東青島，266001?通信作者