陳 龍，李茂輝，康元環(huán)，曹 亮，單曉楓，王姣姣，錢愛東

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春 130118）

吉林省豬源沙門菌毒力基因檢測(cè)及耐藥性分析

陳 龍，李茂輝，康元環(huán)，曹 亮，單曉楓，王姣姣，錢愛東

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春 130118）

為了解吉林省規(guī)模化豬場(chǎng)豬群中沙門菌的攜帶、毒力基因分布及耐藥性等情況，本試驗(yàn)于2013年間采集吉林省規(guī)?；i場(chǎng)豬直腸拭子540份，經(jīng)細(xì)菌分離、生化鑒定、分子生物學(xué)鑒定，共檢出豬源沙門菌18株，檢出率3.33%，同時(shí)對(duì)菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)、毒力基因檢測(cè)及致病性試驗(yàn)。結(jié)果顯示，18株分離株對(duì)鏈霉素耐藥率為72.22%，對(duì)四環(huán)素耐藥率為72.22%，其他藥物耐藥率普遍高于22.2%，且多重耐藥嚴(yán)重。此外，共檢測(cè)10種毒力基因，其中sse C、spv A、spv R三種基因檢出率分別為72.2%、72.2%、83.3%。小鼠致病性試驗(yàn)中，有11株分離株對(duì)小鼠具有較強(qiáng)的致病性（61.1%）。表明分離沙門菌存在多重耐藥現(xiàn)象，且致病力的增強(qiáng)可能與毒力島和毒力質(zhì)粒的存在有關(guān)。

豬；沙門菌；藥敏試驗(yàn)；毒力基因

沙門菌（Salmonella）是引發(fā)人和動(dòng)物食物中毒、胃腸炎的重要的人畜共患病原菌，其在臨床上較為常見，治療時(shí)，常常盲目的使用抗生素，導(dǎo)致多重耐藥菌株的出現(xiàn)。此外，該菌還具有多種毒力基因，主要存在于質(zhì)粒和染色體上的毒力島中[1]，沙門菌粘附到宿主組織后通過毒力因子侵襲宿主細(xì)胞，導(dǎo)致宿主患病及死亡[2]，因此，豬源沙門菌的流行情況值得重視。目前，我國多個(gè)省市已開展了豬源沙門菌攜帶的調(diào)查與研究，但是卻未見吉林省的報(bào)道。本研究采用直腸棉拭子對(duì)吉林省部分規(guī)模化養(yǎng)豬場(chǎng)健康豬沙門菌進(jìn)行分離，用常規(guī)理化及PCR方法對(duì)其進(jìn)行鑒定，并對(duì)耐藥性以及主要毒力基因進(jìn)行分析，為豬源沙門菌病的預(yù)防、診斷和治療提供科學(xué)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 TTB增菌液、SC增菌液、BS瓊脂、H.E.瓊脂、三糖鐵（TSI）瓊脂，購自青島海博生

物技術(shù)有限公司；生化發(fā)酵管、革蘭染色液、藥敏紙片，購自杭州天和微生物試劑有限公司；DNA Marker DL-2 000、Taq DNA聚合酶，購自寶生物工程（大連）有限公司；DNA凝膠回收試劑盒、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，購自北京索萊寶技術(shù)有限公司等

1.2 細(xì)菌分離純化 病料來源為2013年3月-2013年8月，選取吉林省長春、松原、四平、遼源、吉林等地區(qū)的規(guī)模化豬場(chǎng)，采集臨床健康豬直腸棉拭子，共計(jì)540份。按照食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.4-2010進(jìn)行初步分離沙門菌，將疑似沙門菌的菌落進(jìn)行純培養(yǎng)，并于4℃保存。

1.3 細(xì)菌鑒定

1.3.1 細(xì)菌的理化鑒定 將純化的細(xì)菌分別進(jìn)行TSI瓊脂鑒別培養(yǎng)、賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、KCN抑制試驗(yàn)、尿素酶試驗(yàn)、糖發(fā)酵試驗(yàn)（甘露醇、山梨醇、衛(wèi)矛醇、水楊苷）、ONPG試驗(yàn)、丙二酸鹽利用試驗(yàn)，具體操作過程與結(jié)果判定參見國標(biāo)GB 4789.4-2010與農(nóng)業(yè)部行標(biāo)NY/T 550-2002。

1.3.2 細(xì)菌的PCR鑒定 采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌基因組，根據(jù)沙門菌invA基因設(shè)計(jì)引物：inv A-F 5′-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3′、inv A-R 5′-TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3′，引物合成由華大基因生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成。反應(yīng)條件為：95℃5 min；94℃1 min，60℃1 min，72℃1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃10min；4℃終止反應(yīng)、保存。PCR產(chǎn)物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司純化并測(cè)序，序列結(jié)果用NCBI-BLAST搜索比對(duì)，鑒定標(biāo)準(zhǔn)按照同源性≥97%判定。

1.3.3 細(xì)菌血清型鑒定 采用玻板凝集法，利用A～F多價(jià)O血清及單因子O血清鑒定菌株的O抗原，H因子血清鑒定其鞭毛抗原，并判定沙門菌種屬。

1.4 藥敏試驗(yàn) 采用CLSI推薦的K-B法進(jìn)行，根據(jù)CLSI（2009）的標(biāo)準(zhǔn)判定其耐藥性。質(zhì)控菌采用大腸埃希菌ATCC25922。

1.5 毒力基因檢測(cè) 對(duì)豬源沙門菌進(jìn)行10種常見的毒力基因的PCR檢測(cè),引物序列見表1。

沙門菌質(zhì)粒毒力基因spv A、spv C、spv R檢測(cè)引物參考GenBank，沙門菌毒力島基因M gt C、org A、ssc A、sse C、sse D、sse E、ar A、bcf的檢測(cè)引物參考文獻(xiàn)[3-4]。采用煮沸法提取細(xì)菌總DNA模本。PCR反應(yīng)體系為25μL。反應(yīng)條件經(jīng)優(yōu)化：95℃5min；94℃1min、退火1min（spv C，spv R為54℃，ssc A、sse E、ar A、bcf為55℃，sse C、sse D為58℃，spv A、M gtC、o rg A為59℃），72℃1min，30個(gè)循環(huán)；72℃10min；4℃終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

表1 PCR擴(kuò)增引物序列

1.6 致病性試驗(yàn) 將鑒定的豬源沙門菌腹腔注射接種健康昆明系小鼠0.2 mL（108CFU/mL），試驗(yàn)前禁食、禁水24 h，每株菌設(shè)5個(gè)重復(fù)，對(duì)照組腹腔注射生理鹽水，隔籠飼養(yǎng)，連續(xù)觀察7 d，觀察并剖檢發(fā)病后死亡的小鼠，按1.3方法對(duì)其進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，并統(tǒng)計(jì)致病率。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離鑒定 540份臨床健康豬直腸棉拭子，通過沙門菌增菌液和沙門菌鑒別培養(yǎng)基、生化發(fā)酵管、PCR特異性基因inv A擴(kuò)增鑒定，證明18株細(xì)菌分離菌株為沙門菌，占采樣總數(shù)的3.33%（18/540）。18株沙門菌經(jīng)血清學(xué)鑒定，其中豬霍亂沙門菌有9株、鼠傷寒沙門菌6株、德爾卑沙門菌2株、劍橋沙門菌1株。

2.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 18株豬源沙門菌對(duì)14種抗生素的藥敏結(jié)果見表2。耐藥頻率顯示，豬源沙門菌分離株至少為4重耐藥、最多為12重耐藥、其余為5重耐藥至11重耐藥均有菌株分布。

2.3 毒力基因檢測(cè)結(jié)果 對(duì)18株豬源沙門菌進(jìn)行10種毒力基因的PCR檢測(cè)，所有毒力基因均有檢出。其中分布于毒力島2上的毒力基因sse C（72.2%），毒力質(zhì)粒上的毒力基因spv R（83.3%）、spv A（72.2%）、spv C（72.2%），遠(yuǎn)高于其他毒力島上的毒力基因，如org A（22.2%）、M gt C（22.2%）、bcf A（11.1%）、ara B（16.7%）、sse D（50%）、sse E（33.3%）。

表2 18株豬源沙門菌藥敏結(jié)果

2.4 致病性試驗(yàn)結(jié)果 將18株豬源沙門菌分離株接種小鼠，試驗(yàn)結(jié)果顯示，多數(shù)分離株對(duì)小鼠具有較強(qiáng)的致病性，其中11株具有致病性（61.1%）；有6株呈現(xiàn)不同程度的發(fā)病后死亡，致死率為33.3%。從致死小鼠體內(nèi)實(shí)質(zhì)器官分離出的細(xì)菌、經(jīng)理化及分子生物學(xué)鑒定、與接種細(xì)菌相同；而對(duì)照組小鼠則無異常。

3 討論

豬源沙門菌是典型的人獸共患病原菌。本試驗(yàn)對(duì)吉林省部分地區(qū)的規(guī)模化養(yǎng)豬場(chǎng)臨床健康豬群沙門菌的攜帶情況進(jìn)行了調(diào)查，共分離出疑似沙門菌35株，進(jìn)一步采用沙門菌種特異性引物invA進(jìn)行驗(yàn)證，最終鑒定出沙門菌18株，分離率為3.33%。

本試驗(yàn)對(duì)18株豬源沙門菌吉林分離株進(jìn)行了14種抗生素的耐藥性分析，結(jié)果顯示，這些菌株對(duì)四環(huán)素（88.89%）、鏈霉素（72.22%）、多西環(huán)素（55.56%），均超過50%。與我國其他省份相比，吉林省豬源沙門菌對(duì)不同抗生素的耐藥情況不盡相同，這與抗生素使用情況和細(xì)菌分離株地區(qū)差異有關(guān)[5]。雖然吉林省豬源沙門菌分離株對(duì)大部分抗生素表現(xiàn)出較高的敏感性，但考慮中度敏感率明顯高于其他省市，因此，在選擇藥物治療沙門菌引發(fā)的疾病時(shí)，要慎用少用這類抗生素。

致病性試驗(yàn)結(jié)果證明，多數(shù)豬源沙門菌分離株對(duì)小鼠具有致病性。此外，豬源沙門菌的致病性與毒力基因關(guān)系密切。本研究對(duì)18株豬源沙門菌進(jìn)行了10種毒力基因的PCR檢測(cè)。結(jié)果表明，從18株豬源沙門菌中檢測(cè)到13株具有sse C基因，且對(duì)小鼠的致病性較高。這可能與sse C基因編碼的sse C蛋白作為Ⅲ型分泌系統(tǒng)中底物蛋白的效應(yīng)蛋白，且SPI2編碼與系統(tǒng)感染有關(guān)的Ⅲ型分泌系統(tǒng)。在致病性的試驗(yàn)中，攜帶較多毒力島2上的毒力基因其致病性顯著高于沒有此基因的菌株；此外，在只檢測(cè)出毒力質(zhì)粒的分離株中，小鼠致病率很高，表明spv的存在能增強(qiáng)菌株的致病力；毒力島和毒力基因同時(shí)存在時(shí)，引起的病變更為嚴(yán)重。相關(guān)文獻(xiàn)表明，SPI1編碼與侵襲力有關(guān)的Ⅲ型分泌系統(tǒng)、SPI3參與沙門菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活有關(guān)、SPI4和SPI5編碼參與細(xì)菌在靶細(xì)胞內(nèi)的相關(guān)蛋白等[6]，然而這些毒力島上的毒力基因org A、M gt C、bcf A、ara B檢出率較低，無法確切說明這些毒力基因與致病性的關(guān)系，因此，尚待進(jìn)一步的研究。

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Virulence gene detection and antibiotic sensitivity of sw ine Salmonella from Jilin province

CHEN Long，LIMao-hui，KANG Yuan-huan，CAO Liang，SHAN Xiao-feng，WANG Jiao-jiao，QIAN Ai-dong
（College of Animal Science and Technology，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China）

To investigate the virulence genes and antibiotic susceptibility of swine Salmonella in Jilin Province，a total of 540 rectal swabs sampleswere collected from health pigs in scale farms in 2013 and 18 isolates of Salmonellawere isolated which were identified bymorphology，physical and chemical characteristics，susceptibility testing,virulence genes detection and pathogenicity. The results showed that the resistance rateswere 72.22%to the drugs of STR and TET，respectively.Other resistance rates were generally higher than 22.2%，and most of the Salmonella isolates weremulti-drug resistance.In addition，the positive rates of the virulence genes of sseC，spvA and spvR were 72.2%，72.2%and 83.3%，respectively.Moreover，11 isolates were proved to be pathogenic tomice（61.6%）.The Salmonella isolated showedmultiple-resistance to Antimicrobial Drugs.The increase of pathoge?nicitymay relate to the plasmid virulence and some pathogenicity island.

Swine；Salmonella；susceptibility testing；virulence genes Corresponding authors：QIAN Ai-dong；SHAN Xiao-feng

S856.65+1

A

0529-6005（2015）11-0082-03

2014-04-04

吉林省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)-生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（201224、201324）

陳龍（1989-），男，博士生，研究方向?yàn)閯?dòng)物細(xì)菌學(xué)，E-mail：944515582@qq.com

錢愛東，E-mail：qianaidong0115@163.com；單曉楓，E-mail：sxf1997@163.com