李宏杰，方軍，蔣彩霞，沈康

（杭州中美華東制藥有限公司，浙江杭州310011）

γ-聚谷氨酸發(fā)酵工藝研究

李宏杰，方軍，蔣彩霞，沈康

（杭州中美華東制藥有限公司，浙江杭州310011）

采用發(fā)酵技術(shù)，利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸，對(duì)γ-聚谷氨酸發(fā)酵工藝進(jìn)行研究。主要研究碳源、氮源、裝液量、接種量、發(fā)酵時(shí)間、pH以及前體谷氨酸鈉和促進(jìn)劑氯化銨對(duì)γ-聚谷氨酸發(fā)酵的影響。前期研究表明，γ-聚谷氨酸發(fā)酵液黏度與其產(chǎn)量線性相關(guān)，故本研究中采用發(fā)酵液黏度作為γ-聚谷氨酸產(chǎn)量的衡量指標(biāo)。通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，最后得到最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件。通過單因素及正交試驗(yàn)，確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：葡萄糖4%，酵母膏0.5%，谷氨酸鈉3%，MgSO4·7H2O 0.025%，K2HPO40.2%，氯化銨0.3%；最佳發(fā)酵條件為：初始pH 9.5，裝液量50mL，接種量6%，搖床轉(zhuǎn)速為220 r/min，37℃振蕩培養(yǎng)72 h。

γ-聚谷氨酸；枯草芽孢桿菌；發(fā)酵工藝

γ-聚谷氨酸（γ-Poly glutamic acid，γ-PGA）是由L-谷氨酸（L-Glu）、D-谷氨酸（D-Glu）單體通過γ-羧基與α-氨基間的γ-酰胺鍵聚合而成的一種多肽分子。由于其具有增稠、乳化、成膜、保濕、絮凝、粘合、無毒、水溶、生物可降解、無毒副作用等特性，適用于食品、化妝品、生物醫(yī)學(xué)、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域。近年來隨著對(duì)γ-聚谷氨酸的深入研究，作為一種新型的高分子生物制品，愈來愈顯現(xiàn)出廣闊的研究及應(yīng)用前景。本課題擬對(duì)γ-聚谷氨酸進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，主要對(duì)γ-聚谷氨酸發(fā)酵工藝進(jìn)行研究，旨在提高γ-聚谷氨酸產(chǎn)量，為γ-聚谷氨酸工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)參考。

1材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1主要化學(xué)試劑

葡萄糖、蔗糖、檸檬酸、可溶性淀粉、牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、谷氨酸鈉、氯化銨等均為市購。

1.1.2主要儀器

電子天平TE612-L：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器SYQ-DSX-280：上海申安醫(yī)療器械廠；超凈工作臺(tái)SW-CJ-1F：蘇州江東精密儀器有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱DPX-9082B-1型：上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；流變儀DV-III：美國Brookfield公司等。

1.1.3試驗(yàn)菌種

試驗(yàn)菌種：枯草芽孢桿菌，杭州中美華東制藥有限公司實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.4培養(yǎng)基

1）斜面培養(yǎng)基（LB培養(yǎng)基）：蛋白胨1%，牛肉膏0.5%，NaCl 0.5%，葡萄糖0.1%，瓊脂2%，酵母粉0.2%，pH 7.5；滅菌條件：121℃，20 min。

2）種子培養(yǎng)基：葡萄糖2%，酵母膏0.5%，谷氨酸鈉2%，MgSO4·7H2O 0.025%，K2HPO40.2%，pH 7.5；滅菌條件：121℃，20 min。

3）發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖4%，酵母膏0.8%，谷氨酸鈉3%，MgSO4·7H2O 0.025%，K2HPO40.2%，pH 7.5；滅菌條件：121℃，20 min。參考，待優(yōu)化。

1.2培養(yǎng)方法

斜面培養(yǎng)：挑取枯草芽孢桿菌保藏菌種接種于斜面培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)13 h～24 h，作為一次活化菌種。將一次活化菌種接種于新鮮斜面培養(yǎng)基中，37℃下靜置培養(yǎng)13 h～24 h，作為二次活化菌種。

種子培養(yǎng)：將二次活化菌種接種于種子培養(yǎng)基，37℃、220 r/min，振蕩培養(yǎng)16 h～24 h作種子液。

發(fā)酵培養(yǎng)：按所需的接種量將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min，振蕩培養(yǎng)48 h，得到含有γ-聚谷氨酸的發(fā)酵液。

1.3試驗(yàn)方案

1.3.1單因素試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基

1）碳源：考察不同碳源碳源對(duì)γ-聚谷氨酸產(chǎn)量的影響，碳源分別為葡萄糖、蔗糖、檸檬酸、可溶性淀粉，其他條件相同，每組試驗(yàn)3個(gè)平行和1個(gè)空白。測定發(fā)酵液的黏度［4］，確定最佳碳源。

2）氮源：考察不同氮源對(duì)γ-聚谷氨酸產(chǎn)量的影響，氮源分別為牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、豆餅粉、固體豆?jié){，其他條件相同，每組試驗(yàn)3個(gè)平行和一個(gè)空白。測定發(fā)酵液的黏度，確定最佳碳源。

3）谷氨酸鈉含量：考察不同谷氨酸鈉含量對(duì)γ-聚谷氨酸產(chǎn)量的影響，其含量分別為0、1%、2%、3%、4%，其他條件相同，每組試驗(yàn)3個(gè)平行。測定發(fā)酵液黏度，確定最適谷氨酸鈉含量。

4）氯化銨含量：考察不同氯化銨含量對(duì)γ-聚谷氨酸產(chǎn)量的影響，其含量分別為0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%，其他條件相同，每組試驗(yàn)3個(gè)平行。測定發(fā)酵液黏度，確定最適氯化銨含量。

1.3.2單因素試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵條件

1）初始pH：考察不同初始pH對(duì)γ-聚谷氨酸產(chǎn)量的影響，pH分別為6、7、8、9，其他條件相同，每組實(shí)驗(yàn)3個(gè)平行。測定發(fā)酵液黏度，確定最適pH的范圍。

2）接種量：考察不同的接種量對(duì)γ-聚谷氨酸產(chǎn)量的影響，接種量分別為2%、3%、5%、7%、10%其他條件相同，每組試驗(yàn)3個(gè)平行。測定發(fā)酵液黏度，確定最適接種量范圍。

3）裝液量：考察不同的裝液量對(duì)γ-聚谷氨酸產(chǎn)量的影響，裝液量分別為30、50、70、100 mL其他條件相同，每組試驗(yàn)3個(gè)平行和1個(gè)空白。測定發(fā)酵液黏度，確定最適裝液量的范圍。

4）發(fā)酵時(shí)間：考察不同的發(fā)酵時(shí)間對(duì)γ-聚谷氨酸產(chǎn)量的影響，發(fā)酵時(shí)間分別為24、48、72、96 h，其他條件相同，每組試驗(yàn)3個(gè)平行和1個(gè)空白。測定發(fā)酵液黏度，確定最適裝液量的范圍。

1.4正交試驗(yàn)發(fā)酵工藝優(yōu)化

1.4.1正交試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基成分配比進(jìn)行優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)對(duì)單因素試驗(yàn)發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳碳源（A）、谷氨酸鈉含量（B）和氮源（C）做其配比的正交實(shí)驗(yàn)（三因素三水平）。其他條件相同，每組實(shí)驗(yàn)3個(gè)平行，測定發(fā)酵液黏度，確定最佳培養(yǎng)基成分。

1.4.2正交試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)對(duì)單因素試驗(yàn)中最佳培養(yǎng)基起始pH（A）、裝液量（B）、接種量（C）和發(fā)酵時(shí)間（D）做正交試驗(yàn)（四因素三水平），其他有條件相同，每組實(shí)驗(yàn)3個(gè)平行，測定發(fā)酵液黏度，確定最佳發(fā)酵條件。

2結(jié)果

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1單因素試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基

按1.4.1所述方法分別研究碳源、氮源、谷氨酸鈉含量、氯化銨含量對(duì)γ-聚谷氨酸產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖1、圖2、圖3、圖4所示。

圖1　碳源對(duì)γ-聚谷氨酸產(chǎn)量的影響Fig.1Effects of carbon sources on the γ-PGA Production

圖2　氮源對(duì)γ-聚谷氨酸產(chǎn)量的影響Fig.2Effects of Nitrogen sources on the γ-PGA production

圖3　谷氨酸鈉含量對(duì)γ-聚谷氨酸產(chǎn)量的影響Fig.3Effects of Monosodium glutamate on the γ-PGA Production

圖4　氯化銨含量對(duì)γ-聚谷氨酸產(chǎn)量的影響Fig.4Effects of NH4Cl on the γ-PGA production

由圖可知，最佳碳源為葡萄糖，則最佳氮源為酵母膏，最佳谷氨酸鈉含量為3%，最佳氯化銨含量為0.3%。

2.1.2單因素試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵條件

按1.4.1所述方法分別研究初始pH、接種量、裝液量、發(fā)酵時(shí)間對(duì)γ-聚谷氨酸產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖5、圖6、圖7、圖8所示。

由圖可知，最佳初始pH為9，最佳接種量為5%，最佳裝液量為50 mL，最佳發(fā)酵時(shí)間為72 h。

2.2正交試驗(yàn)發(fā)酵工藝優(yōu)化結(jié)果

2.2.1正交試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基成分配比進(jìn)行優(yōu)化

按2.4.1所述方法對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基成分配比進(jìn)行優(yōu)化，因素水平表見表1，結(jié)果與分析見表2。

圖5　初始pH對(duì)γ-聚谷氨酸產(chǎn)量的影響Fig.5Effects of initial pH on the γ-PGA Production

圖6　接種量對(duì)γ-聚谷氨酸產(chǎn)量的影響Fig.6Effects of Inoculation quantity on the γ-PGA production

圖7　裝液量對(duì)γ-聚谷氨酸產(chǎn)量的影響Fig.7Effects of Liquid loading on the γ-PGA Production

圖8　發(fā)酵時(shí)間對(duì)γ-聚谷氨酸產(chǎn)量的影響Fig.8Effects of fermentation time on the γ-PGA production

由表2可以看出，B因素是影響指標(biāo)值的最主要因素，各因素對(duì)γ-聚谷氨酸產(chǎn)量影響主次順序?yàn)锽＞A＞C，最佳組合為A2B2C2，同時(shí)相同條件做表2中最佳組合A2B2C3，得到發(fā)酵液的黏度分別為2.097 mPa·s和2.103 mPa·s，黏度相差不大，酵母膏的量影響不大，考慮成本，選最佳組合為A2B2C2。

表1　L9（33）正交試驗(yàn)因素水平表Table 1Factor level L9（33）of the orthogonal test%

表2　L9（33）正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2Result of the orthogonal test L9（33）

2.2.2正交試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化

按1.4.2所述方法對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，因素水平見表3，結(jié)果與分析見表4。

表3　L9（34）正交試驗(yàn)因素水平表Table 3Factor level L9（34）of the orthogonal test

由表4可知，C因素是影響指標(biāo)值的最主要因素，各因素對(duì)γ-聚谷氨酸產(chǎn)量影響主次順序?yàn)镃'＞B＞'A'＞D'，最佳組合為A3'B2'C3'D2'。相同條件做A3'B2'C3'D2'和表4中最佳組合A2'B2'C3'D1'，得到發(fā)酵液的黏度分別為1.937mPa·s和1.903mPa·s，則最佳組合為A3'B2'C3'D2'。

表4　L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果Table 4Result of the orthogonal test L9（34）

3結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)得到最佳發(fā)酵工藝：葡萄糖4%，酵母膏0.5%，谷氨酸鈉3%，MgSO4·7H2O 0.025%，K2HPO40.2%，氯化銨0.3%，初始pH9.5，121℃滅菌20 min，250 mL三角瓶，裝液量50 mL，接種量6%，搖床轉(zhuǎn)速為220 r/min，37℃振蕩培養(yǎng)72 h。

［1］G G Meynell，E Meynell.The Biosynthesis of Poly d-glutamic Acid apsular Material of Bacillus anthracis［J］.General Microbiology.1966，43（1）:119-128

［2］陳詠竹，孫啟玲.γ-多聚谷氨酸（γ-PGA）生產(chǎn)菌的誘變選育及重金屬吸附的應(yīng)用研究［D］.四川:四川大學(xué)，2005

［3］曹旭，徐志南.γ-多聚氨酸的異源表達(dá)及發(fā)酵工藝的研究［D］.杭州:浙江大學(xué)，2007

［4］李文靖.γ-聚谷氨酸發(fā)酵及提取工藝研究［D］.濟(jì)南:山東輕工業(yè)學(xué)院，2010

Study on Fermentation Process of γ-PGA

LI Hong-jie，F(xiàn)ANG Jun，JIANG Cai-xia，SHEN Kang
（Hangzhou East China Pharmaceutical Group Co.，Ltd.，Hangzhou，310011，Zhejiang，China）

In this study，the fermentation technology was used to produce γ-PGA with Bacillus subtilis fermentation，and the fermentation process technology of γ-PGA is studied.The influence of the output of γ-PGA was the main researched，such as the carbon source，nitrogen source，liquid volume，inoculation，fermentation time，pH and sodium glutamate precursor and the promoter of ammonium chloride.Previous studies had shown that γ-PGA fermentation broth viscosity linearly related to its production，the viscosity of the fermentation broth was used as γ-PGA output measure.The optimum medium composition and the optimum fermentation conditions scope were determined by single factor experiment orthogonal experiment.The optimum medium of the fermentation obtained through the single factor and orthogonal experiments was：4%glucose，0.5%yeast extract，sodium glutamate 3%，MgSO47H2O 0.025%，K2HPO40.2%，ammonium chloride，0.3%；Optimum fermentation conditions were：initial pH 9.5，medium volume 50mL，inoculum size 6%，rotation speed of 220 r/min，37℃oscillator cultured 72 h.

γ-poly glutamic acid；Bacillus subtilis；fermentation process

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.14.020

2015-02-26

李宏杰（1978—），男（漢），工程師，本科，研究方向：藥物發(fā)酵工藝研究。