劉立增，孟憲昉，郭俊杰，白正晨

（天津商業(yè)大學(xué)理學(xué)院化學(xué)系，天津300134）

紅曲紅色素在淀粉顆粒表面吸附機(jī)制研究

劉立增，孟憲昉，郭俊杰，白正晨

（天津商業(yè)大學(xué)理學(xué)院化學(xué)系，天津300134）

利用索氏提取和薄層色譜分離技術(shù)，從市售紅曲紅中得到1種含羥基紅曲紅色素。該紅曲紅色素水溶液與馬鈴薯淀粉、玉米淀粉、小麥淀粉、紅薯淀粉所形成懸浮物，掃描電鏡、偏光實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明紅曲紅色素在淀粉顆粒表面發(fā)生了物理吸附，且吸附作用沒有改變淀粉的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。落射熒光實(shí)驗(yàn)表明該紅曲紅色素?zé)晒忸伾珵辄S色或綠色，熱臺(tái)實(shí)驗(yàn)表明該色素不適用于220℃的加工條件。

淀粉；紅曲色素；吸附；熒光；掃描電鏡

紅曲色素是由紅曲霉屬（Monascus）的絲狀真菌生成的色素，一直以來被認(rèn)為是安全性較高的天然食用色素［1-2］。紅曲色素在肉制品、水產(chǎn)品、配制酒、冰棍、餅干、果凍、膨化食品、調(diào)味類罐頭、奶制品、植物蛋白、果品等中都有應(yīng)用［3］，廣泛應(yīng)用于調(diào)味品、面制品、酒業(yè)等食品工業(yè)中。食品加工過程中pH［4-6］，溫度［7］，光照［8-9］，金屬離子［10］，食品添加劑［11-12］等因素對(duì)紅曲色素穩(wěn)定性影響研究已取得較大進(jìn)展，但對(duì)于應(yīng)用中紅曲色素與蛋白質(zhì)、淀粉等基質(zhì)間的相互作用報(bào)道較少。研究表明，紅曲色素有可能通過物理吸附作用：如（1）通過紅曲色素替代亞硝酸鹽作為肉制品著色劑直接染色，賦予肉制品特有的“肉紅色”和風(fēng)味，不僅抑制有害微生物的生長，延長保存期，而且紅曲色素的應(yīng)用安全性更高［13-15］；（2）將紅曲色素粉直接加入到醬醅中參與發(fā)酵，明顯提高醬油的紅色指數(shù)，同時(shí)改善了醬油的風(fēng)味［16］；（3）紅曲色素可以替代醬油作為腌制蔬菜中外加色素，通過物理吸附作用滲入蔬菜內(nèi)部，蔬菜細(xì)胞吸附紅曲色素而改變?cè)瓉淼念伾?7］，使醬腌菜的色澤更誘人；（4）紅曲色素在面制品生產(chǎn)中的應(yīng)用產(chǎn)，紅曲餅干、紅曲面包、糕點(diǎn)、紅曲面條等，在香味方面，與不加紅曲提取液制成的面包相比，更加清新獨(dú)特［18］。本文主要利用落射熒光和掃描電鏡等技術(shù)，對(duì)紅曲紅色素與淀粉間的物理吸附作用情況進(jìn)行研究，為進(jìn)一步研究、開發(fā)和使用紅曲色素提供理論參考。

1材料與方法

1.1儀器與試劑

BK-FL4落射熒光顯微鏡、SMART-POL偏光顯微鏡（Optec CCD TP310 digital camera）：重慶奧特光學(xué)儀器有限責(zé)任公司；KER3100-08S型精密恒溫工作臺(tái)：重慶奧特光學(xué)儀器有限責(zé)任公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；S-4800掃描電子顯微鏡：日本日立公司。

馬鈴薯淀粉、玉米淀粉、小麥淀粉、紅薯淀粉：市售。紅曲紅：山東中惠食品有限公司；正己烷、乙酸乙酯、無水甲醇、無水乙醇（分析純）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；乙腈、甲醇（色譜純）：Merck公司。

1.2實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.1制備紅曲紅色素的方法

稱取市售紅曲紅30 g溶于300 mL甲醇中，過200目～300目硅膠快速柱（直徑45 mm，淋洗劑為甲醇）。待淋洗液接近無色后，旋干。將所得紅曲色素裝入紙包，放置于索式提取器中。配制300 mL正己烷和乙酸乙酯的混合液（體積比為1∶1）作為索氏提取溶劑。待萃取液無色后。將萃取劑換為150 mL甲醇進(jìn)行二次萃取。將所得甲醇提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮后得紅曲紅色素初級(jí)品。甲醇溶解，薄層色譜分離初級(jí)品（CH2Cl2∶CH3OH=3∶1），旋干。得紅曲紅色素產(chǎn)物純品。

1.2.2淀粉吸附紅曲紅色素實(shí)驗(yàn)

取適量的1.2.1制備的紅曲紅色素樣品溶于蒸餾水中，調(diào)節(jié)其初始吸光度為1.0。分別量取該紅曲紅色素水溶液5、10、15 mL與1 g淀粉（馬鈴薯淀粉，玉米淀粉，小麥淀粉，紅薯淀粉）混合，不加紅曲紅色素作為空白實(shí)驗(yàn)。超聲下充分混合10 min后。離心5 min，將試管底部淀粉色素混合物所形成的淀粉乳取適量滴于載玻片上，加上蓋玻片，避光干燥24 h。

1.2.3淀粉吸附紅曲紅色素落射熒光、偏光、掃描電鏡實(shí)驗(yàn)

將1.2.2制備的紅曲紅色素淀粉乳樣品片，置于顯微鏡樣品臺(tái)上，觀察淀粉顆粒的形貌。分別在B光（420 nm～480 nm）和偏振光下拍攝淀粉顆粒的照片。使用KER3100-08S型精密恒溫工作臺(tái)，升溫速度1℃/s，溫度范圍25℃～220℃。

將1.2.2制備的紅曲紅色素淀粉乳樣品片，樣本均勻地分散在樣品處理臺(tái)上，用離子衍射儀在其表面進(jìn)行噴金、固定，采用S-4800型掃描電子顯微鏡（SEM）對(duì)淀粉樣品微觀形貌進(jìn)行觀察，加速電壓：3 kV；放大倍數(shù)：2 000倍。

2結(jié)果與討論

2.1分離樣品的準(zhǔn)備

市售紅曲色素是混合物，一般所得的產(chǎn)品都含有3種顏色的多種組分。近年來許多學(xué)者采用薄層層析法、樹脂吸附分離法、柱層析、微乳法等方法方法獲得了不同色調(diào)的純色素［19-22］。本文正己烷、乙酸乙酯分別作為萃取溶劑進(jìn)行索氏提取，分別將橙色素、黃色素提取出來后，甲醇作為溶劑索氏提取出紅色素。將所得甲醇提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮，干燥后，薄層色譜（20 cm×20 cm）分離，展開劑為CH2Cl2∶CH3OH=3∶1。使用刮刀將Rf=0.4的色帶刮下，甲醇溶解，過濾，旋干。得紅曲紅色素產(chǎn)物純品。研究結(jié)果表明，該色素在化學(xué)結(jié)構(gòu)上是一種含有羧基的紅曲紅色素［23］。

2.2淀粉對(duì)紅曲紅色素吸附作用及溫度的影響

紅曲紅色素不穩(wěn)定，容易受到發(fā)酵溫度、浸提溫度、保存溫度等因素的影響［24-25］。目前多數(shù)報(bào)道均是關(guān)于紅曲紅色素醇溶液或水溶液穩(wěn)定性隨溫度的變化［26-27］。對(duì)水溶性紅曲紅色素吸附于淀粉表面的熱穩(wěn)定性研究不多。本文采用落射熒光顯微鏡對(duì)紅曲紅色素在淀粉表面吸附后的熱穩(wěn)定性進(jìn)行了考察。溫度對(duì)淀粉吸附紅曲紅色素的影響見圖1。

圖1　25℃和220℃下馬鈴薯淀粉（a，b）、玉米淀粉（c，d）、小麥淀粉（e，f）、紅薯淀粉（g，h）吸附紅曲紅色素落射熒光實(shí)驗(yàn)Fig.1The EPI-fluorescence photographs of potato starch（a，b），maize starch（c，d），wheat starch（e，f），sweet potato starch（g，h）adsorbed by red monascus pigment at 25℃or 220℃

實(shí)驗(yàn)表明室溫下色素吸附于馬鈴薯淀粉、玉米淀粉、小麥淀粉、紅薯淀粉表面后，在落射420 nm～480 nm波長激發(fā)下，紅曲紅色素?zé)晒忸伾珵辄S色或綠色（520 nm～570 nm）。220℃下加熱30 min后，紅曲紅色素的熒光強(qiáng)度都有明顯的減弱現(xiàn)象，原因可能是在較高溫度下，一部分紅曲紅色素分子發(fā)生了分解。對(duì)比4種淀粉的落射熒光強(qiáng)度可知，紅薯淀粉對(duì)色素的吸附作用要優(yōu)于其它3種淀粉。

2.3紅曲紅色素吸附對(duì)淀粉偏光影響

淀粉顆粒內(nèi)部存在著2種不同的結(jié)構(gòu)：結(jié)晶結(jié)構(gòu)和無定形結(jié)構(gòu)。在結(jié)晶區(qū)淀粉分子鏈?zhǔn)怯行蚺帕械模跓o定形區(qū)淀粉分子鏈?zhǔn)菬o序排列的，這2種結(jié)構(gòu)導(dǎo)致偏振光通過淀粉顆粒時(shí)形成了偏光十字，即產(chǎn)生光學(xué)各向異性現(xiàn)象。當(dāng)有水、醇等溶劑存在時(shí)，淀粉顆粒會(huì)發(fā)生溶脹、糊化，內(nèi)部淀粉分子鏈有序排列的結(jié)晶結(jié)構(gòu)被破壞，就會(huì)使偏光十字消失［28］。吸附紅曲紅色素對(duì)淀粉的偏光的影響見圖2。

圖2　馬鈴薯淀粉（a）、玉米淀粉（b）、小麥淀粉（c）、紅薯淀粉（d）吸附紅曲紅色素偏光實(shí)驗(yàn)Fig.2The polarized light photographs of potato starch（a），maize starch（b），wheat starch（c），sweet potato starch（d）adsorbed by red monascus pigment

可以觀察到在紅曲紅色素與馬鈴薯淀粉、玉米淀粉、小麥淀粉、紅薯淀粉分別混合過程中，溶于蒸餾水中的紅曲紅色素與淀粉顆粒之間發(fā)生了吸附現(xiàn)象。淀粉顆粒呈現(xiàn)明顯的紅色，但淀粉的偏光十字變化不是很大。圖2結(jié)果表明溶于蒸餾水的紅曲紅色素在淀粉表面吸附過程中，沒有改變淀粉顆粒內(nèi)部的結(jié)構(gòu)。

2.4淀粉吸附紅曲紅色素的掃描電鏡

淀粉吸附紅曲紅色素的掃描電鏡結(jié)果見圖3（X2000倍）。

從圖3中可明顯看出：與未經(jīng)處理的淀粉光滑表面比較而言，采用與紅曲紅色素混合法處理的淀粉表面增加了表層結(jié)構(gòu)，其與原淀粉光滑的表面結(jié)構(gòu)形成了鮮明的對(duì)比。此種表面結(jié)構(gòu)的存在表明紅曲紅色素水溶液與淀粉充分混合干燥后，色素對(duì)淀粉顆粒進(jìn)行了包埋。

2.5淀粉與紅色素吸附機(jī)理

本研究組對(duì)中惠有限公司的色素進(jìn)行分離，分離得到的紅曲紅色素是一類多羥基化合物［23］。同時(shí)淀粉顆粒表面布滿了親水性的羥基，與水溶性的含多羥基的紅色素分子間能形成氫鍵。經(jīng)分析，我們認(rèn)為吸附機(jī)理如圖4所示。

圖4　淀粉與紅曲紅色素分子間氫鍵作用和落射熒光實(shí)驗(yàn)Fig.4The sketch map of H-bond formation and EPI-fluorescence for the starch-red monascus pigment

淀粉高分子鏈中每個(gè)葡萄糖單體單元的2，3，6位羥基與紅曲紅色素分子的3個(gè)羥基間可形成一個(gè)，兩個(gè)或3個(gè)氫鍵。多個(gè)氫鍵的存在提高了淀粉基質(zhì)與被吸附物質(zhì)的相容性和對(duì)其吸附能力。并且吸附于淀粉顆粒表層的紅曲紅色素在420 nm～480 nm落射光照射下，發(fā)射出520 nm～570 nm的熒光。

3結(jié)論

通過索氏提取與薄層色譜相結(jié)合的方法，提純得到一種化合物結(jié)構(gòu)中含3個(gè)羥基的紅曲紅色素分子。落射熒光與掃描電鏡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，含3羥基紅曲紅色素分子與淀粉顆粒間存在以氫鍵為主的物理吸附作用，且此種物理吸附作用在220℃下仍保持一定的穩(wěn)定性。偏光實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明紅曲紅色素水溶液并未改變淀粉的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，紅曲紅色素水溶液只在淀粉顆粒表面發(fā)生了相互吸附作用。研究結(jié)果不僅對(duì)紅曲色素發(fā)酵生產(chǎn)、紅曲色素的應(yīng)用以及都有如何改善淀粉對(duì)水溶性物質(zhì)的吸附能力和提高吸附結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性能，拓寬淀粉應(yīng)用領(lǐng)域提供了有益的參考。

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Study on the Adsorption Mechanism of Red Monascus Pigment on the Surface of Starch

LIU Li-zeng，MENG Xian-fang，GUO Jun-jie，BAI Zheng-chen
（School of Science，Tianjin University of Commerce，Tianjin 300134，China）

A kind of red monascus pigment containing hydroxyl group was gotten by Soxhlet extraction and TLC separation technology from a commercially available red Monascus.The suspended substance were formed in the red monascus pigment aqueous solution and potato starch，corn starch，wheat starch，sweet potato starch.The scanning electron microscopy，polarizing experimental results showed that red monascus pigment was adsorbed on the starch granule surface by physical adsorption，and the adsorption process did not change the internal structure of starch.The results of EPI-fluorescence experiments indicated that the red monascus pigment fluorescence color was yellow or green，the results of hot stand experiments showed that the pigment must be used under to 220℃.

starch；red monascus pigments；absorption；fluorescence；SEM

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.14.011

2015-05-21

劉立增（1973—），男（漢），講師，博士，研究方向：食品添加劑。