常晨晨 王燕 管珊 孫素榮

（新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830046）

重組駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白與順鉑聯(lián)合抑制黑色素瘤B16細(xì)胞增殖效應(yīng)的研究

常晨晨 王燕 管珊 孫素榮

（新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830046）

旨在探討重組駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白（Recombinant Peganum harmala lipid transfer protein，rPhLTP）與順鉑（DDP）聯(lián)用對(duì)鼠黑色素瘤B16細(xì)胞增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用。MTT法檢測(cè)rPhLTP、順鉑單獨(dú)及聯(lián)用后對(duì)鼠黑色素瘤B16細(xì)胞增殖的影響；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，活性氧（Reactive oxygen species，ROS）和線(xiàn)粒體膜電位（Δψm）的變化情況。結(jié)果顯示，rPhLTP和DDP聯(lián)用后細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率和凋亡率顯著高于DDP單獨(dú)處理組（P ＜ 0.01）；而且胞內(nèi)ROS升高的水平均高于單獨(dú)處理組（P ＜ 0.01），胞內(nèi)Δψm水平均低于單獨(dú)處理組，但無(wú)顯著性差異。rPhLTP可增強(qiáng)順鉑對(duì)B16細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，與順鉑具有協(xié)同作用。

重組駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白；順鉑；鼠黑色素瘤B16；增殖抑制

惡性黑色素瘤是發(fā)生在皮膚和黏膜之間且可轉(zhuǎn)移的一種高度惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢(shì)［1］。順鉑（Cislpatin，DDP）是臨床上常用化療藥物，廣泛用于治療各種癌癥［2］，但具有耳毒性、腎毒性等毒副作用且腫瘤易對(duì)其產(chǎn)生耐藥性［3-5］，使其臨床應(yīng)用受到限制。

植物非特異性脂轉(zhuǎn)移蛋白（Non-specific lipid transfer proteins，nsLTPs）是一類(lèi)普遍存在于植物體內(nèi)的小分子、多功能、堿性可溶性的蛋白［6］，因?qū)χ|(zhì)分子具有廣泛親和力［7］，在體外可將磷脂等脂質(zhì)體從表面轉(zhuǎn)運(yùn)至線(xiàn)粒體中而得名［8］，具有轉(zhuǎn)脂［9-11］、抗菌及抑制腫瘤［12］等作用。Lin等［13］從甘藍(lán)中分離的LTP可抑制肝癌Hep G2細(xì)胞和乳腺癌MCF 7細(xì)胞的增殖，其IC50為5.8和1.6 μmol/L。此外，Tousheh等［14］研究發(fā)現(xiàn)水稻nsLTPs，在細(xì)胞內(nèi)還可作為抗癌藥物載體。脂轉(zhuǎn)移蛋白所具有的多種生物活性，目前已受到科學(xué)界廣泛關(guān)注。

駱駝蓬（Peganum harmala）是蒺藜科（Zygophyllaceae）駱駝蓬屬（Peganum）的一種多年生草本植物，具有止咳平喘、消寒助陽(yáng)的作用，其生物堿具有殺蟲(chóng)、抗菌、鎮(zhèn)痛、抗癌的作用［15］。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，從傳統(tǒng)維藥駱駝蓬種子中分離出的駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白（Peganum harmala Lipid transfer protein，PhLTP），在體外對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有抑制生長(zhǎng)作用，且對(duì)正常細(xì)胞毒性較小［16］。通過(guò)基因工程手段獲得的重組駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白（rPhLTP）在體內(nèi)具抑瘤作用［17］。本研究旨在探討重組PhLTP和DDP聯(lián)合應(yīng)用對(duì)黑色素瘤B16細(xì)胞增殖和凋亡是否有協(xié)同效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料

16細(xì)胞為鼠黑色素瘤細(xì)胞，為本實(shí)驗(yàn)室保存。重組駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白rPhLTP為本課題組誘導(dǎo)表達(dá)純化。順鉑購(gòu)自齊魯制藥有限公司，1640培養(yǎng)基及胎牛血清（美國(guó)Gibco公司），MTT及DMSO（美國(guó)sigma公司），Annexin V-FITC/PI apoptosis kit（聯(lián)科生物公司），DCFH-DA、DiOC6（3）（美國(guó)Sigma公司），胰酶，3423型二氧化碳培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司），流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組 細(xì)胞培養(yǎng)于含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10 g/L FBS的1640培養(yǎng)基，37℃，5% CO2飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中孵育。實(shí)驗(yàn)分組為：空白對(duì)照組、rPhLTP組、DDP組、rPhLTP與DDP聯(lián)合組。rPhLTP的終濃度梯度為10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL，80 μg/mL，DDP的終濃度梯度為2.5 μg/mL、5 μg/mL和10 μg/mL及兩藥協(xié)同（rPhLTP 10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL + DDP 2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL），rPhLTP及DDP用1640培養(yǎng)基配制。

1.2.2 MTT法檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用 將5×104個(gè)/ mL細(xì)胞接種于96孔板，每孔100 μL，待細(xì)胞貼壁后分別加入藥物作用24 h后，吸棄廢培養(yǎng)液，每孔加入20 μL的MTT（5 mg/mL）和80 μL培養(yǎng)基，作用4 h后吸棄上清，每孔加入150 μL DMSO，避光震蕩15 min后在490 nm處檢測(cè)吸光值。根據(jù)公式，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=［1（-實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值）（/對(duì)照組OD值-空白組OD值）］× 100 %，計(jì)算抑制率。rPhLTP和DDP的聯(lián)合作用效果根據(jù)兩藥作用系數(shù)（Coefficient of drug interaction，CDI）計(jì)算，CDI=AB/（A×B），AB為兩藥聯(lián)合作用的OD值與對(duì)照組OD值的比值，A或B為單藥處理組OD值與對(duì)照組OD值的比值。當(dāng)CDI ＜ 1時(shí)，表明兩藥具有協(xié)同作用，當(dāng)CDI ＜ 0.75時(shí)，表明協(xié)同作用極顯著［18］。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 將4×105個(gè)/mL細(xì)胞接種于6孔板中，總體積為2 mL。細(xì)胞貼壁后分別加入不同濃度的藥物作用24 h后，收集各處理組細(xì)胞，分別按AnnexinV-FITC/PI apoptosis kit試劑盒說(shuō)明書(shū)說(shuō)明書(shū)操作，用FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.4 胞內(nèi)活性氧（ROS）的檢測(cè) 將4×105個(gè)/mL細(xì)胞接種于6孔板，每孔2 mL，待細(xì)胞貼壁后分別加入藥物作用24 h后收集細(xì)胞，沉淀加1.5 μmol/L DCFH-DA，37℃孵育15 min。收集細(xì)胞使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5 線(xiàn)粒體膜電位（Δψm）的檢測(cè) 將4×105個(gè)/mL細(xì)胞接種于6孔板，每孔2 mL，待細(xì)胞貼壁后分別加入藥物作用24 h后，收集細(xì)胞，離心，沉淀加4 nmol/L的DiOC6（3），37℃避光15 min后離心，PBS重懸，流式細(xì)胞儀檢測(cè)（激發(fā)波長(zhǎng)484 nm，吸收波長(zhǎng)501 nm）的熒光強(qiáng)度，Cell Quest軟件分析結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

各組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，用Prism 5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，采用雙因素方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)分析，P＜0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 rPhLTP、DDP單獨(dú)或聯(lián)用對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的影響

MTT結(jié)果顯示（表1），當(dāng)用10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL的rPhLTP處理 細(xì) 胞后，檢測(cè)到對(duì)B16細(xì)胞的增殖抑制率分別為（23.36 ± 0.043）%、（36.59 ± 0.076）%、（47.13 ± 0.059）%、（83.58 ± 0.062）%，2.5 μg/mL、5 μg/mL和10 μg/mL的DDP處理細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)其對(duì)細(xì)胞的增殖抑制率分別為（16.68 ± 0.098）%、（29.46 ± 0.108）% 和（34.98 ± 0.044）%。結(jié)果表明不同濃度的rPhLTP或DDP單藥處理B16細(xì)胞后，與空白對(duì)照組相比，濃度為20 μg/mL、40 μg/mL的rPhLTP以及濃度為5 μg/mL、10 μg/mL的DDP具有顯著性差異（P ＜ 0.05），濃度為80 μg/mL的rPhLTP具有極顯著性差異（P ＜ 0.01），rPhLTP和DDP單獨(dú)作用對(duì)B16細(xì)胞的增殖抑制具濃度依賴(lài)性。當(dāng)不同濃度的rPhLTP、DDP共同作用后對(duì)B16細(xì)胞的增殖抑制作用均高于單藥處理組，且40 μg/mL rPhLTP與2.5 μg/mL DDP協(xié)同作用后，對(duì)B16細(xì)胞的增殖抑制率為（59.51 ± 0.185）%，顯著高于高濃度的DDP（10 μg/mL）處理后細(xì)胞的增殖抑制率，同時(shí)也顯著高于40 μg/mL rPhLTP處理后對(duì)細(xì)胞的增殖抑制率（P ＜0.01）。通過(guò)計(jì)算兩藥聯(lián)合作用指數(shù)CDI，發(fā)現(xiàn)不同濃度的 rPhLTP與不同濃度的DDP聯(lián)合作用后，CDI均小于1，說(shuō)明rPhLTP可增強(qiáng)DDP對(duì)B16細(xì)胞的增殖抑制作用，具有協(xié)同效應(yīng)。

2.2 rPhLTP與DDP聯(lián)合應(yīng)用對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

Annexin V-FITC/PI雙染檢測(cè)結(jié)果（圖1，表2）顯示，不同濃度的rPhLTP處理B16細(xì)胞24 h后，檢測(cè)到凋亡率分別為（3.33 ± 0.034）%、（4.21 ± 0.78）%、（6.17 ± 0.19）% 和（9.32 ± 0.15）%，與對(duì)照組相比均具有顯著性差異（P ＜ 0.05）；不同濃度的DDP處理后檢測(cè)到其凋亡率分別為（2.15 ± 0.27）%、（3.03 ± 0.19）% 和（4.42 ± 0.11）%，與對(duì)照組相比濃度為5 μg/mL和10 μg/mL的DDP具有顯著性差異（P ＜ 0.05），表明不同濃度的rPhLTP與DDP可以濃度依賴(lài)性的方式誘導(dǎo)B16細(xì)胞發(fā)生凋亡。當(dāng)rPhLTP與DDP聯(lián)合作用作用B16細(xì)胞后，檢測(cè)到其凋亡率均高于單藥處理組細(xì)胞的凋亡率，且當(dāng)不同濃度的rPhLTP與10 μg/mL的DDP聯(lián)用后，檢測(cè)到其凋亡率均顯著高于高濃度的DDP（10 μg/mL）處理后細(xì)胞的凋亡率（4.42 ± 0.11）%（P ＜ 0.05），當(dāng)高濃度的rPhLTP（40 μg/mL）與2.5 μg/mL的DDP聯(lián)合后其對(duì)細(xì)胞的凋亡率（6.69 ± 0.69）% 顯著高于高濃度的DDP（10 μg/mL）處理后細(xì)胞的凋亡率（4.42 ± 0.11）%（P ＜ 0.01）。

表1 rPhLTP與DDP單獨(dú)及聯(lián)合作用對(duì)B16細(xì)胞的增殖抑制

2.3 胞內(nèi)活性氧（ROS）的檢測(cè)

當(dāng)細(xì)胞受到外界物質(zhì)刺激而發(fā)生凋亡時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的ROS水平會(huì)發(fā)生變化。為了檢測(cè)rPhLTP與DDP 單獨(dú)及聯(lián)合作用是否對(duì)B16細(xì)胞ROS產(chǎn)生影響，采用DCFH-DA熒光染料對(duì)處理的細(xì)胞進(jìn)行染色。結(jié)果（表3）表明，當(dāng)用10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL和80 μg/mL的rPhLTP 處理細(xì)胞后，檢測(cè)到ROS的平均熒光強(qiáng)度（MIF）分別為（143.66 ± 5.98）%、（230.44 ± 1.12）%、（290.05 ± 1.66）%、（310.55 ± 1.59）%， 用 2.5 μg/mL、5 μg/mL和 10 μg/mL的DDP處理細(xì)胞后檢測(cè)到ROS的MIF分別為（169.28 ± 4.01）%、（245.67 ± 3.09）%和（268.25 ± 3.80）%。說(shuō)明隨著rPhLTP或DDP濃度的增加，胞內(nèi)ROS的水平也呈上升的趨勢(shì)，與對(duì)照組相比濃度大于40 μg/mL的rPhLTP以及濃度大于5 μg/mL的DDP均具有顯著性差異（P ＜ 0.05）。rPhLTP與 DDP聯(lián)合作用后檢測(cè)到ROS的MIF均高于rPhLTP、DDP單獨(dú)處理細(xì)胞后胞內(nèi)的ROS水平，且20 μg/mL rPhLTP與低濃度的DDP（2.5 μg/mL）聯(lián)合作用胞內(nèi)的ROS為（308.87 ± 8.92）%，顯著高于高濃度的DDP（10 μg/mL）單獨(dú)處理細(xì)胞后胞內(nèi)的ROS（268.25 ± 3.8）% 水平，同時(shí)也顯著高于20 μg/mL rPhLTP單獨(dú)處理細(xì)胞后胞內(nèi)ROS（230.44 ± 1.12）%的水平（P ＜ 0.01）。結(jié)果提示rPhLTP與DDP聯(lián)合作用B16細(xì)胞后，可使胞內(nèi)的ROS水平發(fā)生變化，說(shuō)明二者聯(lián)合誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡可能與ROS的升高相關(guān)。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)B16細(xì)胞凋亡率

表2 rPhLTP與DDP聯(lián)合作用對(duì)B16細(xì)胞凋亡率的影響

表3 rPhLTP與DDP聯(lián)合作用對(duì)B16細(xì)胞ROS的影響

2.4 線(xiàn)粒體膜電位（Δψm）的檢測(cè)

在凋亡的細(xì)胞中，由于線(xiàn)粒體會(huì)受到損失而使橫跨線(xiàn)粒體的膜電位下降或消失。在本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)DiOC6（3）熒光染料檢測(cè)rPhLTP、DDP 單獨(dú)及聯(lián)用后B16細(xì)胞中線(xiàn)粒體膜電位（Δψm）的變化。結(jié)果見(jiàn)圖2和表4，當(dāng)10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL和80 μg/mL的rPhLTP處理細(xì)胞后其胞內(nèi)Δψm的MIF分別為（95.04±086）%、（94.38 ± 0.10）%、（90.13 ± 1.20）%和（83.63 ± 1.20）%，2.5 μg/mL、5 μg/mL及10 μg/mL的DDP處理后檢測(cè)Δψm的MIF分別為（93.75 ± 0.65）%、（90.19 ± 0.34）%和（85.67 ± 0.93）%，表明rPhLTP、DDP單獨(dú)作用B16細(xì)胞后，胞內(nèi)Δψm的水平以濃度依賴(lài)性的方式降低。rPhLTP與DDP聯(lián)用后，Δψm降低的水平較單藥處理組細(xì)胞高。

圖2 不同濃度的rPhLTP作用后B16細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位的改變

表4 rPhLTP與DDP聯(lián)合作用對(duì)B16細(xì)胞Δψm的影響

3 討論

惡性黑素瘤在體內(nèi)的自然凋亡率比其它腫瘤要低，具有抵抗藥物誘導(dǎo)凋亡特性，且其預(yù)后差［1］，因此有必要研究探討治療惡性黑素瘤的有效方法。順鉑（DDP）被用于治療多種腫瘤，其機(jī)制涉及DNA損傷和誘導(dǎo)線(xiàn)粒體凋亡從而激活腫瘤細(xì)胞凋亡信號(hào)發(fā)揮作用［2，19］，但DDP毒副作用大［3-7］，因此需要尋找一種藥物與其聯(lián)用以減輕其不良反應(yīng)。植物脂轉(zhuǎn)移蛋白可以抑制癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡［12-14］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)重組駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白及重組真核質(zhì)粒均能抑制體內(nèi)黑色素瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)［17，20］，預(yù)示駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白在治療黑色素瘤中具有潛在應(yīng)用價(jià)值。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用MTT法檢測(cè)了rPhLTP合用DDP時(shí)對(duì)B16細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果表明當(dāng)40 μg/mL rPhLTP與2.5 μg/mL DDP共同作用后，對(duì)B16細(xì)胞的增殖抑制率顯著高于單藥處理組（P ＜ 0.01），兩藥聯(lián)合作用指數(shù)CDI均＜1，說(shuō)明rPhLTP可增強(qiáng)DDP對(duì)B16細(xì)胞的增殖抑制效應(yīng)，對(duì)B16細(xì)胞有化療增敏作用。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)二者合用對(duì)B16細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同濃度的rPhLTP與DDP可以濃度依賴(lài)性的方式誘導(dǎo)B16細(xì)胞發(fā)生凋亡，當(dāng)rPhLTP與DDP聯(lián)合作用B16細(xì)胞后，檢測(cè)到其凋亡率均高于單藥處理組細(xì)胞的凋亡率，且當(dāng)40 μg/mL的rPhLTP與2.5 μg/mL的DDP聯(lián)合后其對(duì)細(xì)胞的凋亡率顯著高于高濃度的DDP（10 μg/mL）處理后細(xì)胞的凋亡率。推測(cè)rPhLTP協(xié)同 DDP對(duì)B16細(xì)胞的增殖抑制作用可能與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，ROS是細(xì)胞凋亡的早期信號(hào)，促使線(xiàn)粒體膜通透性改變，使線(xiàn)粒體膜電位下降，還能與caspase-9前體、ATP/dATP形成凋亡體，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［21］。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡誘導(dǎo)信號(hào)的刺激后，胞內(nèi)的ROS會(huì)升高，可上調(diào)自噬以殺傷腫瘤細(xì)胞［22］。梁曉松等［23］研究表明大黃素可提高腫瘤細(xì)胞內(nèi)ROS水平，從而提高癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。本研究發(fā)現(xiàn)rPhLTP與DDP聯(lián)用胞內(nèi)的ROS水平均高于rPhLTP、DDP單獨(dú)處理組，提示兩藥聯(lián)用誘導(dǎo)B16細(xì)胞發(fā)生凋亡可能依賴(lài)于胞內(nèi)ROS放大信號(hào)的作用，通過(guò)線(xiàn)粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

許多研究結(jié)果表明線(xiàn)粒體是細(xì)胞凋亡的核心，線(xiàn)粒體膜電位對(duì)維持線(xiàn)粒體正常功能是十分必要的，大多抗癌藥物在誘導(dǎo)各種類(lèi)型細(xì)胞凋亡均伴隨線(xiàn)粒體膜電位的下降，一旦線(xiàn)粒體膜電位崩潰，細(xì)胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)［24］。如劉浩等［25］研究表明白藜蘆醇可通過(guò)降低黑色素瘤細(xì)胞的線(xiàn)粒體膜電位，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)rPhLTP、DDP單獨(dú)作用細(xì)胞后胞內(nèi)Δψm隨藥物濃度的升高而降低，且兩藥聯(lián)用后胞內(nèi)Δψm水平均低于rPhLTP、DDP單獨(dú)處理后胞內(nèi)Δψm水平，但無(wú)顯著性差異。提示rPhLTP與DDP可能協(xié)同作用于線(xiàn)粒體，通過(guò)降低線(xiàn)粒體膜電位，破壞線(xiàn)粒體穩(wěn)定性，使誘導(dǎo)凋亡的因子釋放到細(xì)胞質(zhì)中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而提高抗腫瘤效果。但二者聯(lián)合應(yīng)用誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制及可能的作用靶點(diǎn)有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

rPhLTP與順鉑有協(xié)同作用，可增強(qiáng)順鉑對(duì)B16細(xì)胞的增殖抑制作用，并以濃度依賴(lài)性的方式促進(jìn)B16細(xì)胞發(fā)生凋亡。

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（責(zé)任編輯 李楠）

The Synergistic Inhibitory Effects of Recombinant Peganum Harmala Lipid Transfer Protein and Cisplatin on the Proliferation of Melanoma B16 Cells in vitro

Chang Chenchen Wang Yan Guan Shan Sun Surong
（Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering，College of Life Science and Technology，Xinjiang University，Urumqi 830046）

This work is to explore how the combination of recombinant Peganum harmala lipid transfer protein（rPhLTP）and cisplatin（DDP）inhibits the proliferation of melanoma B16 cells and induces the apoptosis of them. MTT assay was used to measure the effects of individual rPhLTP and DDP and combination of them on the proliferation of melanoma B16 cells. The cell apoptosis rate， reactive oxygen species（ROS）， and mitochondrial transmembrane potential（Δψm）level were measured using flow cytometry. The results showed that both inhibitory rate and apoptosis rate by the combination of rPhLTP and DDP were significantly higher（P ＜ 0.01）than by individual DDP or rPhLTP，moreover also levels of ROS raised inside cells by the combination were higher than by individuals（P ＜ 0.01）. However， the levels of Δψm inside the cells by the combination were lower than those by individuals， but the differences between the combination and individuals were not such significant. In conclusion， rPhLTP enhanced the inhibitory effect of DDP on the proliferation of B16 cells and promoted the cell apoptosis，indicating that rPhLTP and DDP has synergistic antitumor effect on B16 cells.

recombinant peganum harmala lipid transfer protein；cisplatin；melanoma B16 cells；proliferation inhibition

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.027

2015-05-27

新疆維吾爾自治區(qū)科技支疆項(xiàng)目（20091129），新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金項(xiàng)目（XJDX0201-2010-06）

常晨晨，女，碩士研究生，研究方向：分子克隆與藥物篩選；E-mail：528193074@qq.com

孫素榮，女，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：細(xì)胞工程與藥物篩選；E-mail：sr_sun2005@163.com