楊輝 楊彬 馬旭通 孫文正 林小鵲 譚世杰

（廣東東陽光藥業(yè)有限公司，東莞 523000）

兩步串聯(lián)層析法純化抗TNF-α單克隆抗體

楊輝 楊彬 馬旭通 孫文正 林小鵲 譚世杰

（廣東東陽光藥業(yè)有限公司，東莞 523000）

旨在建立從重組CHO細胞發(fā)酵培養(yǎng)液中純化抗TNF-α單克隆抗體的兩步串聯(lián)層析法。將含有抗TNF-α單克隆抗體的料液經兩次離心、一步過濾的預處理后，用protein A填料捕獲，陽離子填料Sourec30精細純化。精細純化過程中利用DoE的方法，采用CCF（Central composite face）設計，探討了洗脫pH值及鹽濃度對純化的影響。純化后的抗TNF-α單克隆抗體經HPLC以及毛細管電泳，檢測其濃度、純度以及多聚體含量。結果顯示，親和層析的最佳洗脫條件為pH4.0。通過DOE優(yōu)化，為達到質量目標（回收率90%以上，純度97%以上，多聚體0.3%），篩選出最佳洗脫范圍為0.05-0.13 mol/L NaCl以及pH5.7-6.0，選定pH6.0與0.10 mol/L NaCl作為Source洗脫條件，此時回收率94.3%，純度97.3%，多聚體0.3%，其質量與參比制劑接近。

兩步抗體純化平臺；抗TNF-α單克隆抗體；親和層析；陽離子交換層析

腫瘤壞死因子（TNF-α）是由單核巨噬細胞激活后分泌的一種細胞因子，能夠與特異受體結合后發(fā)揮多種生物學效應，包括免疫激活、炎癥反應。類風濕性關節(jié)炎（Rheumatoid arthritis，RA）是一種以慢性侵蝕性關節(jié)炎為特征的自身免疫炎性疾病，致殘率較高。在RA 患者的關節(jié)的滑膜液中TNF-α呈高表達，它會引起病理性炎癥，并且破壞關節(jié)，因此TNF-α 抑制劑可以用于治療RA，因此能中和TNF-α的抗TNF-α單克隆抗體成為研究的熱點。

現(xiàn)在工業(yè)領域單克隆抗體純化的方法主要包括離心、過濾以及柱層析等方法，其中柱層析的方法又包括親和層析、離子層析、疏水層析和復合層析等［2-6］。工業(yè)上純化單克隆抗體通常采用三步純化法［7］，即通過三步串聯(lián)的層析來獲得達到質量標準的原料藥。而兩步串聯(lián)層析工藝比較少見，因為兩步串聯(lián)層析工藝往往很難達到原料藥的質量要求。本研究通過親和層析與陽離子層析串聯(lián)的兩步串聯(lián)層析，對CHO細胞表達的人源化抗TNF-α單克隆抗體進行純化，旨在提高回收率和純度，為進一步的工藝放大提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

參比制劑（全人源抗TNF-α抗體，原研美國Abbvie）；抗TNF-α單克隆抗體由本實驗室制備（CHO細胞系由本實驗構建表達），通過兩次離心后過0.2 μm濾膜獲得；GE avant 25中低壓層析儀（檢測波長為280 nm）、PALL層析柱2根（1. 0 cm ×20 cm，內填裝GE MabSelect SuRe填料以及GE Source30陽離子填料）、Agilent1260 HPLC（安捷倫公司）、BECKMAN PA800 Plus毛細管電泳系統(tǒng)（BECKMAN 公司），其他試劑均為分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 親和層析柱純化 將裝填好的protein A層析柱連接到層析系統(tǒng)上，用3倍柱體積上樣緩沖液（25 mmol/L PBS pH7.0）平衡柱子，然后樣品進行直接上樣（原樣品經過3 000×g 兩次離心過0.2 μm濾膜），用2倍柱體積平衡緩沖液沖洗柱子（基線平穩(wěn)），然后用不同pH值（3.4、3.6、3.8、4.0和4.2）的洗脫緩沖液（50 mmol/L檸檬酸緩沖液）進行洗脫，收集洗脫組分，檢測。

1.2.2 陽離子層析柱純化 將裝填好的陽離子Source30 層析柱連接到層析系統(tǒng)上，用3倍柱體積上樣緩沖液（50 mmol/L PBS pH6.0）平衡柱子，然后進行上樣（上樣量30 mg/mL，樣品被調節(jié)pH6.0），用3倍柱體積平衡緩沖液沖洗柱子（基線平穩(wěn)），然后用不同pH值及不同鹽濃度的洗脫緩沖液進行洗脫，收集洗脫組分，檢測。洗脫步聚為：先用pH為6.5、6.0、5.5的50 mmol/L PBS條件進行洗脫，選出最佳pH值，然后在此pH上加入不同濃度鹽進行洗脫優(yōu)化。

1.2.3 HPLC測定抗TNF-α單克隆抗體濃度 用0.1 mol/L磷酸緩沖液以2 mL/min流速平衡HPLC系統(tǒng)15 min至基線平穩(wěn)，于系統(tǒng)程序中設置標準曲線法程序。進樣25 μL于進樣器，以2 mL/min流速洗脫，記錄所檢測的標準品對應濃度的峰面積和樣品峰面積，計算樣品濃度。計算公式：Ci=Ai/As*Cs，Ci：測定樣品濃度（ mg/mL）；Cs：標準品濃度（mg/mL）；Ai：供試品峰面積；As：標準品峰面積。溶液抗體含量公式：M=Ci*V，M為溶液抗體含量（mg）；V為溶液體積（mL）。

1.2.4 毛細管電泳系統(tǒng)測定抗TNF-α單克隆抗體純度 毛細管電泳系統(tǒng)分別用1 mol/L NaOH 洗5 min、水洗5 min 及分離緩沖液洗10 min 。每次進樣前，分別用0.1 mol/L NaOH 及分離緩沖液洗1 min 后即可進樣。

1.2.5 HPLC測定多聚體含量 取25 μL樣品加緩沖液1 mL稀釋，上樣10 μL，流速0.5 mL/min；檢測波長為280 nm。

2 結果

2.1 親和層析優(yōu)化及鑒定

在前期預實驗中，保留時間、電導及緩沖液對純化效果的影響不大，不是關鍵參數(shù)。只有pH的影響較大，是關鍵性參數(shù)，所以在實驗中針對pH進行一定的優(yōu)化。表1中，此親和填料的上樣載量為20 mg/mL，樣品經離心過濾處理后無需調節(jié)直接上樣，實驗了不同的洗脫pH值3.4、3.6、3.8、4.0及4.2，結果表明，除pH4.2，回收率無顯著差別，而pH4.0時純度與多聚體最佳，達到了95.3%及2.0%。選取pH4.0作為親和層析的洗脫條件（圖1-3）。

2.2 陽離子層析優(yōu)化及鑒定

對陽離子Source 30的兩個洗脫參數(shù)（洗脫pH、洗脫鹽濃度）進行DoE設計優(yōu)化，兩個參數(shù)設計區(qū)間分別洗脫pH（5.5-6.5）以及洗脫鹽濃度（0.05-0.15 mol/L NaCl），利用GE avant 25自帶的DoE程序進行實驗設計，采用的中心復合表面設計（Central Composite Face，CCF），共11個實驗（包含3個中心點），并對結果進行DoE分析。對回收率、純度及多聚體來說，模型擬合參數(shù)R2分別為0.930、0.931以及0.954，表明數(shù)據(jù)與擬合模型的擬合度很高。圖4表示二因素影響關于回收率、純度、多聚體的等高線圖。最佳的條件是需要滿足純度高、多聚體含量低，而且回收率盡量高。DoE的優(yōu)勢之一在于：通過擬合模型以及制定的因變量范圍，預測自變量取值區(qū)間。為達到參比制劑質量水平（純度97%以上，回收率90%以上，多聚體0.3以下），合適的條件范圍為0.05-0.13 mol/L NaCl以及pH5.7-6.0。 可以選定pH6.0與0.10 mol/L NaCl作為Source 30的洗脫條件（表2），圖6與圖7是實驗10的結果，實驗10的質量與參比制劑基本一致，且回收率有94.3%，回收率相對較高（圖5）。

表1 親和層析純化數(shù)據(jù)表

圖1 protein A在洗脫pH4.0純化色譜圖

圖2 protein A在洗脫pH4.0純化樣品多聚體檢測圖

圖3 親和層析在洗脫pH4.0純化樣品非還原純度圖

3 討論

隨著多種“重磅炸彈”治療性單抗專利到期，越來越多的生物藥公司加入到單克隆抗體藥物的仿制大軍之中。目前，約70%-80%的抗體純化使用了protein A、protein G親和層析，因為該法可一步從細胞培養(yǎng)上清液中幾乎完全純化抗體，絕大多數(shù)的藥廠都采用親和層析作為捕獲層析，有研究表明protein A一步親和層析純度能達90%-95%［8-17］。實驗中對protein A填料的不同洗脫pH值進行了優(yōu)化，得到pH4.0時為最佳。此時回收率為98.5%，非還原純度為95.3%，多聚體含量為2.0%。

由于上游發(fā)酵工藝的控制，電荷異質性已達到參比制劑的水平，所以無需進一步在下游純化工藝上進一步優(yōu)化。而宿主蛋白（Host cell protein，HCP）、DNA經過兩步層析已達到參比制劑的水平（數(shù)據(jù)末在文中列出）。另外，在親和層析后有一步病毒滅活以及在陽離子之后有一步病毒的過濾（未在文中表述），經過這些措施后病毒去除已達法規(guī)要求。陽離子層析是純化過程中常用的一種層析技術，它的原理主要是抗體與雜質基于不同帶電性質與帶電量差異進行分離，與配基所帶電荷相反的物質被結合，相同的電荷不結合。而鹽與抗體則是競爭性的結合配基，鹽濃度越大，結合力越大，意味著抗體越容易被洗脫［18-20］。決定離子層析的純化效果的一個很重要的因素就是分辨率，而分辨率受多種因素的影響，包括填料粒徑、配基、孔徑和緩沖液環(huán)境等，其中粒徑對分辨率的影響很顯著，粒徑越小，分辨率越高，選取GE 制備性填料中粒徑最小的陽離子填料Source30，接在親和填料protein A之后進一步優(yōu)化，它的粒徑為30 μm，且其基質為復合物聚苯乙烯/二乙烯苯，可以耐受很高壓力，適合工業(yè)放大。多聚體的形成機理復雜且種類較多，根據(jù)不同的分類方式有可逆的多聚體及不可逆的多聚體；也可以分為二聚體、三聚體及多聚體等等；多聚體是由單體聚合產生，它的形成相對于單體而言在電荷及分子大小上發(fā)生了改變，本研究選用的陽離子Source30基于抗體電荷差異來分離單體與多聚體；同時由于Source30粒徑越小，填料的分子篩效應越明顯，通過分子量差異分離的效果也就更明顯。DoE分為很多類型，有全因子設計、中心復合序貫設計（CCC）、中心復合設計（CCI）、中心復合表面設計（Central composite face，CCF），Box-behnken設計等等，本實驗采用的是CCF設計，探討了洗脫pH值及鹽濃度對純化的影響，通過陽離子Source DoE優(yōu)化，為達到參比制劑質量水平（純度97%以上，回收率90%以上，多聚體0.3以下），篩選出最佳條件范圍為0.05-0.13 mol/L NaCl以及pH5.7-6.0，選定pH6.0與0.10 mol/L NaCl作為Source洗脫條件。此時回收率94.3%，純度97.3%，多聚體0.3%，其質量與參比制劑接近。本研究中建立的采用protein A 串聯(lián)陽離子Source30兩步層析法純化抗TNF-α單克隆抗體，有回收率高、純度高的特點，為其進一步的工業(yè)放大提供了實驗依據(jù)。

表2 陽離子Source DoE CCF實驗設計參數(shù)與結果

圖4 DoE CCF設計等高線圖

圖5 實驗10純化色譜圖

圖6 實驗10洗脫樣品多聚體圖

圖7 實驗10洗脫樣品非還原純度圖

4 結論

通過優(yōu)化，親和層析的最佳洗脫條件為pH4.0。第二步的陽離子填料Source30的篩選出最佳洗脫范圍為0.05-0.13 mol/L NaCl及pH5.7-6.0，選定pH6.0與0.10 mol/L NaCl作為Source洗脫條件，此時回收率94.3%，純度97.3%，多聚體0.3%。

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（責任編輯 馬鑫）

A Two-step Series Chromatography for the Purification of Anti-TNF-α Monoclonal Antibody

Yang Hui Yang Bin Ma Xutong Sun Wenzheng Lin Xiaoque Tan Shijie
（Sunshine Lake Pharma Co.，Ltd，Dongguan 523000）

The objective of this work is to establish a two-step series chromatography method for purification of anti-TNF-α monoclonal antibodies（mAbs）from recombinant CHO cell culture medium. Anti-TNF-α mAbs from harvested cell culture fluid（HCCF）after 2 times centrifugation and 1 filtration were captured using filler of protein A， from which the eluant was then further finely purified using the positive ion filler Source30 resin. During fine purification， the effects of pH and salt concentration of the Source30 on the purification was investigated using the DoE method and CCF（Central Composite Face）to achieve the optimal mAbs recovery and purity as well as the lowest aggregate content. The concentration and aggregation ratio of the purified mAbs were determined by HPLC and the purity by CE-SDS. Results were as the followings. The optimal elution pH for protein A affinity chromatography was 4.0. After DoE optimization， in order to reach the quality target（＞90% recovery， ＞ 97% purity， and ＜ 0.3% aggregate）， the optimal elution range was 0.05-0.13 mol/L NaCl at pH 5.7-6.0. The elution buffer containing 0.10 mol/L NaCl at pH 6.0 was chosen as the optimal condition of Source elution with 94.3% product recovery， 97.3% purity， and 0.3% aggregate， i. e. ， very close to those in the

tandard. In conclusion， we have successfully developed and optimized a two-step series chromatography method at the laboratory scale for the purification of anti-TNF-α mAbs with high recovery， high purity， and low aggregate content.

two-step chromatography antibody purification platform；anti-TNF-α monoclonal antibody；affinity chromatography；cation exchange chromatography

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.011

2015-03-29

廣東省引進創(chuàng)新科研團隊計劃（201101Y0104990178）

楊輝，男，碩士，研究方向：生物技術藥物；E-mail：highman52@163.com；楊彬同為本文第一作者

孫文正，男，博士，研究方向：生物技術藥物；E-mail：sunwenzheng@hecpharm.com