史連宏等

摘要：目的 建立黑龍江和河北地區(qū)大青葉蛋白指紋圖譜，為不同地區(qū)大青葉的鑒別和質(zhì)量評價(jià)提供依據(jù)。方法 采用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）技術(shù)，對黑龍江和河北地區(qū)的大青葉樣品進(jìn)行鑒別。結(jié)果 河北大青葉蛋白亞基的最大分子質(zhì)量為168.2 kD，最小為19.8 kD，亞基1、6含量最高；黑龍江大慶大青葉蛋白亞基的最大分子質(zhì)量為175 kD，最小為24.4 kD，亞基1、2、4含量最高；黑龍江哈爾濱大青葉蛋白亞基的最大分子質(zhì)量為175 kD，最小為27.7 kD，亞基1、3含量最高。結(jié)論 SDS-PAGE技術(shù)可以用于鑒別不同地區(qū)大青葉。

關(guān)鍵詞：大青葉；鑒別；十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.09.021

中圖分類號：R282.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號：1005-5304（2015）09-0076-03

Analysis on Isatidis Folium Protein in Heilongjiang and Hebei Provinces by SDS-PAGE SHI Lian-hong， YANG Xin， ZHAI Chun-mei， MENG Yong-hai （Key Laboratory of Basic and Application Research of North Chinese Medicine of the Ministry of Education， Heilongjiang University of Chinese Medicine， Heilongjang Key Laboratory of Pharmacodynamic Material Bases of TCM and Nature Medicine， Harbin 150040， China）

Abstract：Objective To build fingerprint of Isatidis Folium protein in Heiongjiang and Hebei Provinces；To provide the basis for the identification and quality evaluation of Isatidis Folium. Methods SDS-PAGE technology was used to identify the samples of Isatidis Folium protein in Heiongjiang and Hebei Provinces. Results Maximum molecular quality of Isatidis Folium protein subunit in Hebei Province was 168.2 kD， and the minimum was 19.8 kD. The subunit 1 and 6 had the highest contents. Maximum molecular quality of Isatidis Folium protein subunit in Daqing area was 175 kD， and the minimum was 24.4 kD. The subunit 1， 2 and 4 had the highest contents. Maximum molecular quality of Isatidis Folium protein subunit in Harbin area was 175 kD， and the minimum was 27.7 kD. The subunit 1 and 3 had the highest contents. Conclusion SDS-PAGE technology can be used to identify Isatidis Folium in different areas.

Key words：Isatidis Folium；identify；SDS-PAGE

根據(jù)《中華人民共和國藥典》，正品板藍(lán)根為十字花科菘藍(lán)屬植物菘藍(lán)Isatis indigotica Fort.的干燥根，菘藍(lán)的干燥葉為大青葉[1]。板藍(lán)根與大青葉性味相似，均為味苦、性寒，均有藥用功效和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，

基金項(xiàng)目：黑龍江省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（H201473）；黑龍江省博士后資助課題（LBH-Z12259）；黑龍江省教育廳科研課題（12531622）；黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)優(yōu)秀青年教師支持計(jì)劃項(xiàng)目（2012RCQ16）

通訊作者：孟永海，E-mail：124391407@qq.com

主要功效為涼血消腫、清熱解毒，有抗內(nèi)毒素的作用[2-3]。其不僅用于臨床治療，還可以預(yù)防疾病，應(yīng)用非常廣泛。本課題組前期建立了不同地區(qū)板藍(lán)根十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）指紋圖譜，明確了不同地區(qū)的板藍(lán)根有差異性，也有相似性[4]。在此基礎(chǔ)上，本研究建立不同地區(qū)大青葉SDS- PAGE指紋圖譜，探討其蛋白差異性。

1 儀器與試藥

酶標(biāo)儀MK3，Peikin Elmer；電泳儀和Universal HoodⅡ電泳自動(dòng)成像儀，美國BIO-RAD生化科技有限公司；Mettler Toledo電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；MIKRO220R離心機(jī)，HETTICH。

SDS-PAGE所用試劑為BIO-RAD生化科技有限公司產(chǎn)品，其他試劑為國產(chǎn)分析純。大青葉樣品產(chǎn)地分別為黑龍江哈爾濱、黑龍江大慶、河北省趙縣，均為栽培品種，每個(gè)產(chǎn)地收集10個(gè)樣品，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室王振月老師鑒定為十字花科菘藍(lán)屬植物菘藍(lán)Isatis indigotica Fort.的干燥葉，采用硅膠快速干燥保存。

2 方法

2.1 植物蛋白提取

采用康為世紀(jì)植物蛋白提取試劑盒（貨號CW2033），按照植物蛋白提取說明書進(jìn)行操作。

2.2 BCA法測定蛋白濃度

參照文獻(xiàn)[5]方法。稀釋牛血清白蛋白（BSA）標(biāo)準(zhǔn)品配制方法見表1。配制BCA工作液：BCA工作液總量=（BSA標(biāo)準(zhǔn)品樣本個(gè)數(shù)+待測樣品）×復(fù)孔數(shù)×每個(gè)樣本BCA工作液體積。將稀釋好的A～G管BSA標(biāo)準(zhǔn)品和待測蛋白樣品各25 μL分別加到作好標(biāo)記的96孔板微孔中，每個(gè)樣本做2～3個(gè)平行反應(yīng)。每孔加入BCA工作液200 μL，充分混勻，蓋上96孔板蓋，37 ℃孵育30 min。冷卻至室溫。用酶標(biāo)儀在540～590 nm范圍內(nèi)測定每個(gè)樣品及BSA標(biāo)準(zhǔn)品吸光值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中的蛋白濃度。蛋白濃度檢測范圍：20～2000 μg/mL。

表1 BSA標(biāo)準(zhǔn)品的配制

管號 稀釋液（μL） BSA標(biāo)準(zhǔn)品（μL） BSA標(biāo)準(zhǔn)品終濃度（μg/μL）

A 0 100 2

B 200 200 1

C 200 200（從B管中?。?0.5

D 200 200（從C管中?。?0.25

E 200 200（從D管中?。?0.125

F 200 200（從E管中?。?0.062 5

G 200 0 0

2.3 蛋白完整性檢測

2.3.1 灌制5%分離膠 ①選擇濃度5%PAGE分離膠，裝配好凝膠模具。②將不同體積的30%Acr-Bis（29∶1）、分離膠緩沖液和雙蒸水在小燒杯或試管中混合。③加入10%過硫酸銨和TEMED，輕輕攪拌使其混勻，避免產(chǎn)生氣泡。④在凝膠模具中灌入適量分離膠溶液，然后在分離膠溶液上輕輕覆蓋一層1～5 cm水層，使凝膠表面保持平整。⑤靜置20 min，待分離膠和水層之間出現(xiàn)一個(gè)清晰的界面后，表明凝膠已聚合。

2.3.2 灌制10%濃縮膠 ①去除覆蓋在分離膠上的水層。②將不同體積的30%Acr-Bis（29∶1）、濃縮膠緩沖液和雙蒸水在一個(gè)小燒杯或試管中混合。③加入10%過硫酸銨和TEMED，輕輕攪拌使其混勻，避免產(chǎn)生氣泡。④將濃縮膠溶液加至分離膠上，直至凝膠溶液到達(dá)前玻璃板的頂端。⑤將梳子插入凝膠內(nèi)，避免產(chǎn)生氣泡。⑥靜置10～20 min，等待濃縮膠聚合。⑦待凝膠聚合后，小心地拔出梳子，以免破壞加樣孔。⑧進(jìn)行常規(guī)電泳操作[6-8]。

3 結(jié)果

3.1 蛋白定量檢測和標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

以蛋白濃度（μg/μL）為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，用Excel制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)公式Y(jié)=0.401X+0.051計(jì)算大青葉蛋白含量。結(jié)果黑龍江哈爾濱、大慶及河北地區(qū)大青葉蛋白含量分別為1.85、2.05、1.68 μg/μL。加裂解液保證3個(gè)地區(qū)蛋白濃度一致，為下一步SDS-PAGE做準(zhǔn)備。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)蛋白泳道和條帶分析

應(yīng)用SDS-PAGE技術(shù)對不同地區(qū)大青葉藥材進(jìn)行研究，黑龍江和河北地區(qū)大青葉蛋白的亞基分布見圖1，用考馬斯亮藍(lán)G250染色后大青葉蛋白質(zhì)條帶清晰，沒有出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，條帶顏色越深說明蛋白含量越高，顏色越淺說明蛋白含量越低。標(biāo)準(zhǔn)蛋白所含亞基數(shù)約為11條，亞基的分子質(zhì)量范圍為10.5～175 kD。標(biāo)準(zhǔn)蛋白泳道和條帶分析見表2。

3.3 不同地區(qū)大青葉蛋白泳道和條帶分析

從圖1可以看出，河北大青葉亞基數(shù)約為9條，亞基分子質(zhì)量范圍為19.8～168.2 kD，亞基1、6含量最高，見表3。黑龍江哈爾濱大青葉所含亞基數(shù)約為5條，亞基分子質(zhì)量范圍為27.7～175 kD，亞基1、3含量最高，見表4。黑龍江大慶大青葉所含亞基數(shù)約為7條，亞基的分子質(zhì)量范圍為24.4～175 kD，亞基1、2、4含量最高，見表5。

綜上，不同地區(qū)板藍(lán)根蛋白SDS-PAGE分離效果良好，黑龍江哈爾濱和大慶大青葉相同條帶為175 kD，河北和黑龍江哈爾濱大青葉相同條帶為67.7 kD，河北和黑龍江大慶大青葉相同條帶為24.7 kD，河北大青葉特征條帶為168.2、59.7、50.7、34.5、26.5、24.7、23.2、19.8 kD，黑龍江哈爾濱大青葉特征條帶為57.8、43.4、27.7 kD，黑龍江大慶大青葉特征條帶為138、62.7、45.5、37.1、31.2 kD。3個(gè)地區(qū)的大青葉有相似條帶，也有特征條帶。

4 討論

為了減少組間差異，本研究對每個(gè)產(chǎn)地的大青葉10個(gè)樣本混合后提取植物蛋白。由于黑龍江地區(qū)大青葉是從河北地區(qū)移栽而來，環(huán)境不同，因此選擇和黑龍江地區(qū)的大青葉進(jìn)行對比。經(jīng)初步研究，，移栽的大青葉在蛋白水平上發(fā)生了變化，但是否影響藥用價(jià)值尚需進(jìn)一步研究。

本研究利用SDS-PAGE技術(shù)對不同產(chǎn)地大青葉樣品進(jìn)行研究，建立大青葉SDS-PAGE指紋圖譜，結(jié)果充分顯示了SDS-PAGE技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)。說明SDS-PAGE技術(shù)能夠準(zhǔn)確地將不同地區(qū)的大青葉完全區(qū)分開來。SDS-PAGE技術(shù)主要用于品種鑒定，尤其是在分子水平上鑒定中藥材非?？煽浚狙芯窟M(jìn)一步說明SDS-PAGE技術(shù)應(yīng)用于中藥材鑒定是可行的，為現(xiàn)代中藥發(fā)展提供了實(shí)踐意義和依據(jù)，為探求中藥材的生物學(xué)實(shí)質(zhì)提供了更為深入的線索。本研究在分子水平上為大青葉品種栽培、種質(zhì)資源研究、質(zhì)量評價(jià)、來源分析提供了試驗(yàn)依據(jù)。

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（收稿日期：2015-01-29）

（修回日期：2015-02-27；編輯：陳靜）