齊計(jì)英，姚依婧，岑　琴，韓　靜，*，鄭士彬

（1.沈陽(yáng)藥科大學(xué)，遼寧沈陽(yáng)110016；2.沈陽(yáng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，遼寧沈陽(yáng)110022）

響應(yīng)面法優(yōu)化雨生紅球藻蝦青素的超聲提取工藝

齊計(jì)英1，姚依婧1，岑琴2，韓靜1，*，鄭士彬1

（1.沈陽(yáng)藥科大學(xué)，遼寧沈陽(yáng)110016；2.沈陽(yáng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，遼寧沈陽(yáng)110022）

以雨生紅球藻為原料，選取乙酸乙酯∶乙醇（v/v，1∶1）為提取溶劑，采用超聲法提取蝦青素，固定液料比為100∶1，以超聲功率、超聲時(shí)間和超聲溫度為因子，蝦青素提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化。三因素對(duì)蝦青素提取率的影響順序?yàn)椋簳r(shí)間＞溫度＞功率。優(yōu)化得到的最佳提取條件為：超聲功率200W、時(shí)間30min、超聲提取溫度25℃，在此條件下提取率可達(dá)1.045%，與預(yù)測(cè)值1.05%相近，表明模型可用。

雨生紅球藻，蝦青素，響應(yīng)面法，超聲提取

蝦青素是類胡蘿卜素的含氧衍生物，屬于酮式類胡蘿卜素，全稱為3，3’-二羥基-4，4’-二酮基-β，β’-胡蘿卜素［1］。蝦青素具有極強(qiáng)的清除自由基和猝滅活性氧的活性［2-4］，此外，蝦青素具有抑制腫瘤發(fā)生、增強(qiáng)免疫功能等多方面的生理作用［5］，特別是抗氧化功能超強(qiáng)，被譽(yù)為“超級(jí)抗氧化劑”，且對(duì)人體絕對(duì)無毒害作用［6］。蝦青素已被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品及養(yǎng)殖行業(yè)［7］。雨生紅球藻（Haematococcus p luvialis）是一種單細(xì)胞微藻，隸屬綠藻門、團(tuán)藻目、紅球藻科、紅球藻屬［8］，是自然界天然蝦青素含量最高的生物，含量達(dá)到干細(xì)胞的2%～4%［9］。由于藻細(xì)胞壁較厚且存在膠質(zhì)，加大了蝦青素的提取難度，所以尋找簡(jiǎn)便、高效的提取方法是大規(guī)模培養(yǎng)雨生紅球藻及其高值商業(yè)化必須解決的問題［10］。

目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已對(duì)蝦青素的提取方法進(jìn)行大量研究，如微波法［11］、低溫研磨萃取法［12-13］、堿提法［14］和加液氮研磨法［12］等［15］。近年來，超聲輔助提取技術(shù)得到了廣泛的應(yīng)用［16］，其中超聲波提取法在中草藥化學(xué)成分提?。?7-18］中已經(jīng)顯示出明顯的優(yōu)勢(shì)，具有省時(shí)、節(jié)能、提取率高等優(yōu)點(diǎn)［19-20］。除了空化和振動(dòng)作用外，超聲波的許多次級(jí)效應(yīng)，如乳化、擴(kuò)散、化學(xué)效應(yīng)等也能促進(jìn)植物中有效成分的轉(zhuǎn)移，使其充分和溶劑混合，促使提取進(jìn)行［21］，現(xiàn)已有超聲-正己烷萃取蝦青素［22-23］等報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)采用超聲水浴提取法從雨生紅球藻孢子中提取蝦青素，并在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面法（response surface methodology）對(duì)超聲提取過程中的各因素進(jìn)行優(yōu)化，以確定提取工藝方案，提高蝦青素提取效果。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）藻粉（＜1.5%）荊州市天然蝦青素有限公司；丙酮、乙酸乙酯、無水乙醇、氯仿、二甲基亞砜（DMSO）等均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

UV2800紫外可見分光光度儀上海舜宇恒平科學(xué)儀器；DF-101S型恒溫加熱磁力攪拌器鞏義英峪予華；DZF-1型真空干燥箱北京光明醫(yī)療；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-52上海亞榮生化儀器；SHZ-D循環(huán)水式真空泵上海博迅實(shí)業(yè)；JY 92-2D超聲細(xì)胞粉碎機(jī)寧波新芝生物科技。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1提取溶劑的確定各取100mg藻粉于燒杯中，分別加入5m L丙酮、乙酸乙酯、無水乙醇、乙酸乙酯：無水乙醇（v/v，1∶1）、乙酸乙酯：無水乙醇（v/v，1∶2）、氯仿、氯仿：無水乙醇（v/v，1∶1）、二甲基亞砜；將燒杯固定在20℃水浴鍋中，安裝超聲探頭，將探頭浸于燒杯溶液中進(jìn)行100W超聲水浴提取30m in；然后進(jìn)行真空抽濾，將濾液分別用各提取溶劑定容至25m L；取1m L溶液減壓濃縮后用DMSO定容至25m L，在492nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。

1.2.2單因素實(shí)驗(yàn)按照1.2.1提取方法，取100mg藻粉于燒杯中，在液料比100∶1，溫度20℃條件下，置于100、150、200、250、300、350W下超聲提取30m in；在功率200W，液料比100∶1，溫度20℃條件下，設(shè)置提取時(shí)間10、20、30、40、50、60m in 6個(gè)水平；在功率200W，液料比100∶1，提取時(shí)間30min條件下，分別置于10、20、30、40、50、60℃下提?。辉诠β?00W，溫度20℃，提取時(shí)間30min條件下，分別選取液料比50∶1、100∶1、150∶1、200∶1、250∶1、300∶1共6個(gè)水平；各組進(jìn)行蝦青素提取率的測(cè)定。

1.2.3蝦青素提取率的測(cè)定采用二甲基亞砜法［24-25］測(cè)定提取液中蝦青素含量。雨生紅球藻中提取得到總蝦青素的濃度C1（mg/m L）：

式中：A492—待測(cè)溶液在492nm波長(zhǎng)下的吸光值；E—蝦青素溶液體積分?jǐn)?shù)為1%、光徑為1cm時(shí)的吸光值，

計(jì)算雨生紅球藻中蝦青素的提取率C2（%）：

式中：V—定容后提取液的總體積，m L；M—所用雨生紅球藻的干重，mg。

1.2.4響應(yīng)面分析優(yōu)化提取參數(shù)的研究以超聲功率（A）、超聲時(shí)間（B）和水浴溫度（C）等因素作為考察對(duì)象，以蝦青素提取率（Y）為響應(yīng)值，采用Design Expert 8.0統(tǒng)計(jì)分析軟件的響應(yīng)面分析法安排實(shí)驗(yàn)，共有17個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)（中心點(diǎn)重復(fù)5次，用于估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差），以獲取最適工藝參數(shù)。實(shí)驗(yàn)水平因素安排見表1。

表1　因素水平表Table 1　The factors and levels

2　結(jié)果與分析

2.1提取溶劑的確定

圖1　不同有機(jī)溶劑的效果Fig.1　Effectof differrentorganic solvents

由圖1可知，不同有機(jī)溶劑提取相同質(zhì)量藻粉所得蝦青素提取率有明顯的差異。蝦青素提取率較大的溶劑為二甲基亞砜、乙酸乙酯∶乙醇（v/v，1∶1），提取率分別為0.963%、0.934%；其次為乙酸乙酯和無水乙醇分別為0.79%和0.807%，丙酮（0.648%）最低。考慮到產(chǎn)品中溶劑殘留的安全性問題，盡量選用無毒無害溶劑，因此最終選用乙酸乙酯：乙醇（v/v，1∶1）作為最佳提取溶劑。

2.2單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖2可知，在提取功率為100～200W時(shí)，蝦青素提取率隨功率的增大而升高，這可能是因?yàn)閷?duì)于一定頻率和一定發(fā)生面的超聲波來說，功率越大，聲強(qiáng)越大，單位時(shí)間內(nèi)超聲產(chǎn)生的空化事件增多，從而有利于提取效果的提高［26］。但在功率超過200W時(shí)，蝦青素提取率隨功率的升高而降低，這是由于超聲產(chǎn)生的高能量使蝦青素降解或異構(gòu)化［27］。因此，選取200W為超聲提取蝦青素的最優(yōu)功率。

由圖3可知，在提取時(shí)間為10～30m in時(shí)，蝦青素提取率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)而提高，但提取時(shí)間超過30m in時(shí)，蝦青素提取率隨時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。這是因?yàn)樘崛r(shí)間的延長(zhǎng)使絕大部分蝦青素提取出來；但是，在沒有抗氧化劑的溶液系統(tǒng)內(nèi)，長(zhǎng)時(shí)間的浸提會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生一系列的化學(xué)反應(yīng)，蝦青素結(jié)構(gòu)中-OH發(fā)生部分氧化分解，使提取率降低。因此，選取30m in為最佳提取時(shí)間。

圖2　超聲功率對(duì)蝦青素提取率的影響Fig.2　Effectof ultrasonication power on the yield of ASTA

圖3　超聲提取時(shí)間對(duì)蝦青素提取率的影響Fig.3　Effect of ultrasonication time on the yield of ASTA

圖4　超聲水浴溫度對(duì)蝦青素提取率的影響Fig.4　Effectofultrasonication temperature on the yield of ASTA

由圖4可知，在提取溫度10～20℃時(shí)，蝦青素提取率隨溫度升高而升高，這是由于蝦青素在提取劑中的溶解度隨溫度的升高而增加。但超過20℃時(shí)蝦青素提取率隨溫度提高而降低，這可能是由于溫度升高，不穩(wěn)定雙鍵在溶液系統(tǒng)產(chǎn)生聚合反應(yīng)，使蝦青素提取率降低。為更好遵循節(jié)能原則，選擇20℃即可。

由圖5可知，當(dāng)液料比小于100∶1時(shí)，藻粉不能完全浸入提取溶劑中；當(dāng)液料比大于等于100∶1時(shí)，藻粉能夠完全浸入提取溶劑中，但是隨著液料比的增加，蝦青素提取率無明顯變化，說明液料比對(duì)蝦青素的超聲提取效果沒有明顯影響。因此，在響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中固定液料比為100∶1。

圖5　提取液料比對(duì)蝦青素提取率的影響Fig.5　Effectof solid-liquid ratio againstastaxanthin extraction yield

2.3響應(yīng)面分析結(jié)果

2.3.1響應(yīng)值結(jié)果見表2。

表2　實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及響應(yīng)值結(jié)果Table 2　Experimentalmatrix and values of observed responses

2.3.2回歸方程利用軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多元回歸擬合，對(duì)表3的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析后得到模型的二次多項(xiàng)回歸方程為：Y=1.02+0.019A+0.13B+ 0.079C+7.500E-004AB-7.750E-003AC+0.012BC-0.18A2-0.29B2-0.073C2

2.3.3方差分析的結(jié)果由表3方差分析可知，擬合的二次多元方程的p＜0.0001，說明用上述回歸方程描述的因變量與全自變量之間的回歸效果高度顯著。因此可以用此模型對(duì)影響蝦青素提取率的因素進(jìn)行分析。由表3可知，B、C、A2、B2對(duì)Y的影響高度顯著，C2對(duì)Y的影響顯著；A對(duì)Y的影響不顯著；AB、AC、BC交互作用不顯著。提取因素對(duì)蝦青素提取率作用強(qiáng)弱的順序?yàn)锽＞C＞A。各因素交互作用響應(yīng)曲面圖如圖6所示。

由圖6可知，響應(yīng)面等高線曲線越陡，說明實(shí)驗(yàn)因子對(duì)蝦青素的提取效果影響越顯著，這和方差分析的結(jié)果相一致。同時(shí)軟件分析得到的復(fù)相關(guān)系數(shù)R2為97.96%，證明該模型擬合程度良好，實(shí)驗(yàn)誤差小，該模型是合適的。對(duì)回歸方程求解，得到最優(yōu)組合為：功率202.00W、時(shí)間32.00m in、溫度26.00℃。考慮到實(shí)驗(yàn)操作可行性，蝦青素最優(yōu)提取條件調(diào)整為：功率200W、時(shí)間30min、溫度25℃，在上述最優(yōu)條件下實(shí)驗(yàn)，重復(fù)三次，測(cè)得蝦青素提取率分別為：1.04%、1.045%、1.05%，取平均值為1.045%，與理論預(yù)測(cè)值1.05%接近，說明經(jīng)過優(yōu)化后的回歸方程對(duì)提取蝦青素進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)非?？煽俊?/p>

表3　響應(yīng)面方差分析Table 3　ANOVA for response surface quadraticmodel

圖6　超聲功率、時(shí)間和超聲水浴溫度三因素交互作用對(duì)蝦青素的提取率影響Fig.6　Responsesurface（3D）showing theeffectofultrasonication power（A），extraction time（B），and ultrasonication temperature（C）on the response value of extraction yield

2.4超聲法與常規(guī)法提取的比較

取兩份同樣的藻粉，分別按上面響應(yīng)面優(yōu)化得到的條件，采用超聲方法和傳統(tǒng)水浴回流方法提取蝦青素，結(jié)果見表4。

表4　不同提取方法的比較Table 4　Comparison of differentextractionmethods

從表4中可以看出，超聲方法更節(jié)能、省時(shí)，提取效率遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)水浴回流。這是因?yàn)樵寮?xì)胞壁厚，采用一般水浴回流提取，有效成分滲出需要的時(shí)間長(zhǎng)、溫度高，蝦青素長(zhǎng)時(shí)間接觸空氣比較容易被氧化；而利用超聲提取技術(shù)，超聲波對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)，將細(xì)胞壁及整個(gè)生物體破裂，極大加快了提取過程，減少能耗、節(jié)時(shí)，提取率提高。

3　結(jié)論

雨生紅球藻中蝦青素含量高，是獲取蝦青素的最好來源，但由于藻細(xì)胞壁較厚，且蝦青素易被氧化、不適宜高溫加熱限制了蝦青素的提取。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用超聲波水浴處理更節(jié)能、省時(shí)，提取效率遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)水浴回流。

通過有機(jī)溶劑選擇實(shí)驗(yàn)，得到最佳提取溶劑為乙酸乙酯∶乙醇（v/v，1∶1）；單因素實(shí)驗(yàn)得到提取條件為超聲功率200W、時(shí)間30m in、超聲提取溫度20℃、液料比100∶1；在單因素的基礎(chǔ)上對(duì)超聲功率、時(shí)間、超聲提取溫度三因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，得最優(yōu)工藝條件：超聲功率、時(shí)間、超聲提取溫度分別為200W、30m in、25℃。在最優(yōu)條件下，進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，蝦青素提取率可達(dá)到1.045%，與理論預(yù)測(cè)值1.05%接近，表明模型可用，可為蝦青素的實(shí)際生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

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Optim ization of ultrasonic extraction technology of astaxanthin from Haematococcus Pluvialis

QI Ji-ying1，YAO Yi-jing1，CEN Qin2，HAN Jing1，*，ZHENG Shi-bin1
（1.Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang 110016，China；2.Shenyang ProductQuality Supervision and Inspection Institute，Shenyang 110022，China）

Haematococcus p luvialis powderwas used as raw material，ethylacetate and ethanol（volume ratio 1∶1）was selected as the best extraction solvent.Taking astaxanthin yield as the evaluation index and ultrasound power，extraction time，and extrac tion temperature as the factors，and fixing radio of solution to material 100∶1，the ultrasound method for extracting astaxanthin was researched.And then，based on the sing le factor experiment，the op timum cond itions to ultrasound extrac ting astaxanthin from Haematococcus p luvialis were got by response surface methodology.The results showed that the effect of the extraction cond itions was time＞tem perature＞ultrasound power，and the op timum extraction conditions were ultrasound power 200W，time 30m in，tem perature 25℃.Under this condition，the extraction rate could reach 1.045%and the content of astaxanthin in Haematococcus p luvialis was 1.05%.The op tim ized modelby RSM agreed wellw ith p ractice.

Haematococcus p luvialis；astaxanthin（ASTA）；response surface methodology；ultrasonic extraction

TS202

B

1002-0306（2015）06-0313-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.06.060

2014-06-18

齊計(jì)英（1988-），女，碩士研究生，研究方向：藥物制劑。

韓靜（1967-），女，博士，教授，研究方向：納米技術(shù)制藥。

遼寧省沈陽(yáng)市科學(xué)技術(shù)局（F13-311-4-00）。