高一龍， 秦海斌， 溫　海， 強京寧， 賀星亮， 張匯東， 馬大君， 朱　騫， 李　剛

（公安部南京警犬研究所， 警犬技術(shù)公安部重點實驗室， 南京 210012）

拉布拉多犬X/Y 精子分選及性別控制冷凍精液制備實驗研究

高一龍， 秦海斌， 溫海， 強京寧， 賀星亮， 張匯東， 馬大君， 朱騫， 李剛

（公安部南京警犬研究所， 警犬技術(shù)公安部重點實驗室， 南京 210012）

目的 探討流式細胞分選技術(shù)在分離拉布拉多犬X、Y 精子方面的應用，并研究拉布拉多犬性別控制（性控）冷凍精液的制備方法。方法 人工按摩刺激法采集8只拉布拉多種公犬精液，利用SX_MOFLO流式細胞儀展開X、Y 精子分離實驗，并對分離后的X/Y精子冷凍、解凍后進行精液重分析和品質(zhì)鑒定。結(jié)果 流式細胞儀分選的X/Y精子純度達到89%以上（89%～91%），X精子平均分離速度（4 260 個/s） 極顯著高于Y 精子分離速度（3 930個/s）（P＜0.01）； 常規(guī)冷凍精液和X、Y 型冷凍精液性別比差異顯著（P＜0.05）； 凍融后活率則無明顯差異（P＞0.05） ； 常規(guī)冷凍精液與X、Y 型冷凍精液解凍后1 h存活指數(shù)差異明顯（P＜0.05） ，分別為0.251±0.006、0.054±0.007 和0.048±0.006； 凍融后頂體完整率差異顯著（P＜0.05）， 分別為77.00%±0.98%、84.66%±1.22% 和84.01%±1.23%。結(jié)論 用流式細胞分選技術(shù)可以獲得高純度的拉布拉多犬X/Y冷凍精液， 性別比和精液品質(zhì)達到低劑量人工授精的要求。

拉布拉多犬； 性別控制（性控）； XY 精子； 流式細胞儀； 精液品質(zhì)

工作犬在消防搜救、治安防范、緝毒、搜爆等方面發(fā)揮著重要作用。由于性別差異， 公犬和母犬在兇猛性、訓練使用的耐力和持久性等方面各有特點。一般而言， 公犬比母犬體格高大， 兇猛性普遍高于母犬， 公犬精力也較母犬充沛； 母犬在氣味作業(yè)過程中嗅認仔細程度好于公犬； 母犬性成熟后， 平均每年發(fā)情兩次， 發(fā)情期間其工作性能普遍下降。因此， 公犬相對比母犬更受歡迎。但對于導盲犬的訓練和使用， 人們則更傾向于選擇性格溫和的母犬。

性別控制（性控）技術(shù)是通過對動物的正常生殖過程進行人為干預， 使雌性成年動物按照人們的意愿生產(chǎn)特定性別后代的動物繁殖技術(shù)， 是一項能顯著提高動物繁殖率的生物工程技術(shù)， 對動物育種、生產(chǎn)和遺傳病的防治均有重要意義。采用流式細胞儀分選X、Y精子， 是目前最可靠且高效的性控技術(shù)。目前流式分選精子技術(shù)在牛、羊、鹿等家畜生產(chǎn)中已廣泛應用， 而在犬上的應用研究相對落后， 鮮見相關(guān)報道。據(jù)報道， 應用流式細胞儀分離的奶牛X精子冷凍精液進行人工授精， 目前已經(jīng)取得了正常受胎率和產(chǎn)母犢率90%的試驗結(jié)果［1］。本實驗是對拉布拉多犬的X、Y 精子分選及冷凍精液制備進行研究， 采用流式細胞儀法分選精子技術(shù)，分離得到拉布拉多犬的高純度X、Y兩性精子，以期建立工作犬XY精子流式分選技術(shù)，并為該技術(shù)在工作犬的繁殖生產(chǎn)中的推廣應用奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1動物南京警犬研究所自繁純種拉布拉多種公犬8 頭。

1.1.2主要儀器流式細胞儀（SX_MOFLO， Dako，F(xiàn)ort Collins， CO， USA）， 超純水機（Millpore，USA），高速低溫離心機（Eppendorf centrifuge5810R，Germany）， 細管精液單頭自動灌裝機（MRS1， IMV，F(xiàn)rance）， 熒光顯微鏡（ZEISS Axio Imager.A1，Germany），程序降溫冷凍儀（Digitcool， IMV， France）等。

1.1.3主要試劑熒光染色試劑Hoechst33342 （Sigma， St Louis， MO， USA）， Food dye（食物色素）（FD&C #40， Warner Jenkinson Company Inc.， St Louis， MO， USA），F(xiàn)ITC- PNA（精子頂體形態(tài)花生凝集素熒光標記），染色試劑盒（Sigma， St Louis， MO，USA）， Tris Buffer（南京天為生物有限公司）， 配液（TALP 稀釋液、分離鞘液、精子接收液、Tris A/B凍存液等）。所用試劑及其他試劑除特別指出外，均為Sigma 公司產(chǎn)品。

1.2實驗方法

1.2.1精液采集在飼養(yǎng)地用人工按摩刺激法采集種公犬精液（每周2～3次）， 收集中段精液部分。將采集后的原精放入15 mL離心管中，然后用封口膜將離心管口封住。再把離心管放到裝有30～34 ℃溫水的保溫杯中，30 min左右短距離運輸至實驗室。

1.2.2精液品質(zhì)檢查精液采集送到實驗室后，立即進行品質(zhì)檢查， 分別檢查精液的濃度、精子的活力， 并用瑞氏-姬姆薩染色液染色以觀察精子的形態(tài)和頂體變化。

1.2.3精子染色選擇精子活力高于0.6，濃度在3×108/mL以上的精液進行熒光染色。根據(jù)上一步檢測的精子濃度， 計算出染色時所要加入稀釋液和精液的比例。在室溫下， 取出拉布拉多犬精子， 650× g離心10 min，吸棄上清液， 用TALP稀釋液稀釋成108/mL， 按順序向試管中加入14 μL Hoechst33342熒光染料（5 g/L）。稀釋后的精液， 搖勻， 樣品在35 ℃的水浴鍋中避光孵育55 min后， 加入同溫同體積的Food dye染液［含有40%卵黃（v/v）和0.002%（v/v）的食物染料］， 染色精子的最終濃度為1×108/mL。將精液經(jīng)30 μm濾器過濾， 除去死亡凝集成團的精子或碎片。

1.2.4流式分選染色處理后的精液上流式細胞儀進行分選， 提前預溫分選鞘液， 基本分選指標參數(shù)為：鞘液壓力40 psi［2］， 紫外激發(fā)光功率150 mW， 按照90%以上的準確率對定向正確的X精子和Y精子設(shè)門分離， R2選取X精子區(qū)域，R3選取Y精子區(qū)域。

1.2.5精子接收用2支50 mL離心管，分別收集分離的X精子和Y精子。分離前預裝進2 mL含20%卵黃的精子接收液，濕潤試管壁，防止精子凝集并為精子提供營養(yǎng)和保護作用［3］。當分離時間達到30 min或分離精子數(shù)量達到5×106，輕搖收集管，搖勻精子和卵黃。

1.2.6精子的冷凍與保存將收集的分離精子以相對離心力850×g， 離心20 min， 棄上清； 再用Tris 冷凍稀釋液調(diào)整獲得的X 或Y 精子濃度， 0.25 mL細管分裝精液使精子數(shù)達到1.4～1.5×106/ 管， 然后按照低溫冷凍儀使用操作規(guī)程進行冷凍操作， 進入降溫程序： 1.5 h 內(nèi)37 ℃降溫至4 ℃， 40 min 內(nèi)4 ℃降溫至-10 ℃， 70 s內(nèi)10 ℃降溫至-100 ℃， 30 s 內(nèi)-100℃降溫至-140 ℃。冷凍儀程序運行完后打開蓋子， 迅速取出冷凍精液細管， 放入液氮中長期保存。

1.2.7凍融分離精子的評估解凍： 將裝有分離精子的冷凍精液細管從液氮中取出， 直接投入30 ℃水浴中， 10 s后取出放入1.5 mL離心管中， 在37 ℃水浴鍋中保存。

1.2.8對冷凍分選精子的檢測

1.2.8.1活力測定從液氮罐中取出常規(guī)拉布拉多犬冷凍精液和X、Y 冷凍精液， 投入37 ℃水浴解凍， 按文獻方法［4］測定活力、1 h 存活指數(shù)。

1.2.8.2頂體完整率檢測［5］解凍后的精子用Tris Buffer離心（800×g，15 min）洗滌后棄上清，加甲醇4 ℃固定30 s，再用Tris Buffer 洗滌1次，棄上清，加入適量Tris Buffer，再加入FITC-PNA使染料濃度為40 μg /mL，37 ℃避光孵育20 min，再用PBS滌1～2次，空氣中自然晾干，再用熒光顯微鏡觀察。在藍色激發(fā)光下，頂體完整的精子，頂體被染成鮮亮的蘋果綠色； 頂體不完整的精子，頂體部分較暗有缺失，計數(shù)頂體完整和不完整的精子，總數(shù)不少于200 個/組。精子頂體完整率（%）=頂體完整的精子數(shù)/精子總數(shù)×100%

1.2.8.3分離精子準確率檢測參照Welch 等［6］方法，進行重分析測定X 和Y 精子的純度。具體操作步驟如下： 在5 mL分離機上機管內(nèi)放入20 μL的熒光染料，再加入l mL的鞘液（pH值為8.0），將100 μL解凍后的精液滴入上機管，上下顛倒混勻，然后將上機管放入34 ℃水浴鍋中溫浴20 min。使用SX_MOFLO流式精子分離機的resorting程序進行純度檢測，記錄數(shù)據(jù)。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有精子活力、分離速度、精子分離準確率、存活指數(shù)、頂體完整率等數(shù)據(jù)資料均采用平均值±標準差表示， 數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計分析軟件，差異分析采用單因素ANOVA 法，LSD法進行多種比較，采用Pearson作變量相關(guān)性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1拉布拉多犬精液的分選效果

8頭種公犬采用人工按摩刺激法采集精液后，通過初步稀釋和短距離運輸，經(jīng)檢測只有3頭種公犬精子的活力在0.6 以上，達到上機分選標準，3臺流式細胞儀同時分選，每支0.25 mL 細管平均分裝約2.1×106個單性精子（圖1）。從表1可以看出，X 精子分離速度為3 890 ～ 4 770 個/s， 明顯高于Y 精子分離速度為3 480～4 260 個/s（P＜0.01）；XY精子的分離準確率約為（89.89±0.65）%。

2.2原精活力對分離效果旳影響

圖1　拉布拉多犬精子流式分選圖

本實驗選取3頭精子活力在0.6以上的拉布拉多種公犬為試驗對象， 選取每頭種公犬的3批次采精， 比較了精子活力與分離速度、分離準確率的關(guān)系。從表1可以看出， 種公犬編號為DL-1、DL-2、DL-4的①、②、③批次之間的原精活力、分離速度和分離準確率均無顯著差異（P＞0.05）。但通過對原精活力與精子分選效果指標間相關(guān)分析（表2），顯示原精活力與分離速度呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)為0.957。結(jié)合表1數(shù)據(jù)，表明DL-1、DL-2、 DL-4的①、②號原精活力均高于③號，且①、②號精子的分離速度也相應地均高于③號； 而所有種公犬的精子分離準確率之間并無顯著差異（P＞0.05）， 與原精活力也無相關(guān)性。

2.3分選冷凍精液與常規(guī)冷凍精液品質(zhì)比較

表1　拉布拉多犬精子活力對分選效果的影響

表2　拉布拉多犬原精活力與精子分選指標之間的相關(guān)分析

表3的數(shù)據(jù)顯示，常規(guī)冷凍精液對照組和分選X、Y組間解凍后精子活力的差異不顯著（P＞0.05），但在凍融后存活指數(shù)、頂體完整率以及性別比這3個冷凍精液品質(zhì)指標之間的數(shù)據(jù)結(jié)果均存在顯著差異 （P＜0.05）， 其中常規(guī)冷凍精液解凍后指數(shù)（0.251 ±0.006）相對X/Y性控冷凍精液有明顯優(yōu)勢，但在凍融后頂體完整率和性別比方面X/Y性控冷凍精液組則顯著優(yōu)于常規(guī)冷凍精液對照組。

表3　分選冷凍精液與常規(guī)冷凍精液品質(zhì)評定比較

3　討論

這是國內(nèi)首次公開報道使用流式細胞分選和冷凍技術(shù)成功分離獲得高純度拉布拉多犬X 和Y 精子，并成功地制備拉布拉多犬性控冷凍精液，為流式分選技術(shù)在工作犬性控中的應用奠定了基礎(chǔ)。

3.1拉布拉多犬的精子分選

目前流式細胞儀分離奶牛X、Y 精子的速度一般可達到每小時1.5×107個［7］， 純度達到90%。研究證明，X精子和Y精子DNA含量差異越大的物種越容易分離，Duane等［1］研究表明，理論上犬的X、Y精子DNA 含量差異較大（3.9%）， 其分選指數(shù)較高， 應該較易于分選。本研究結(jié)果表明， 拉布拉多犬精子分選實驗是成功的，因為分選速度較高，X、Y 精子經(jīng)冷凍后重分析鑒定純度為89.11%和90.67%，主要指標也能夠滿足低劑量AI 的要求。

雖然本次實驗成功獲得拉布拉多犬的X、Y 性控精液， 但總體分離效率低于奶牛，最終參加分選的精子只有總樣本數(shù)的3/8， 分析主要原因有： （1）拉布拉多犬精液濃度較低，約3×108/mL， 而奶牛的精液一般在7×108/mL以上，犬的精液濃度低就不能充分稀釋，經(jīng)過一定距離保存運輸后活力變差；（2） 種公犬的精液總量較低，只有2～3 mL； （3）流式分離機的大部分分選參數(shù)是參照牛的標準設(shè)定的。所以在后續(xù)的試驗中通過加強供精種公犬的選擇，提高供精犬的精子質(zhì)量，改良稀釋保護液延長保護時間、縮短運輸距離以及優(yōu)化流式分選參數(shù)， 進一步提高拉布拉多犬精子分離效率是可能的。

3.2分選冷凍精液的精子質(zhì)量

從本文結(jié)果可以看出， X、Y 型冷凍精液解凍后活力分別為42.33%±2.00%和41.67%±1.73%。而Merlo等［8］染色分離了14頭混合品種雄性犬的X/ Y精子精液，其分離效果較好，X、Y精子純度可以達到85%左右，但解凍后的活力只有2.4 %± 1.2%。與Merlo等研究結(jié)果相比，純度相差不大但活力有相差懸殊，這表明本實驗在分離X、Y精子后的冷凍稀釋及低溫存儲的流程等技術(shù)環(huán)節(jié)方面處理比較得當。

在凍融后頂體完整率和性別比方面，X/Y性控冷凍精液組顯著優(yōu)于常規(guī)冷凍精液對照組。主要是因為XY性控冷凍精液的精子，都是優(yōu)中選優(yōu)的單性X/Y精子， 在分選的程中頂體畸形、斷尾以及活力差、死亡精子都被直接淘汰， 所以XY性控冷凍精液的頂體完整率和性別比要優(yōu)于常規(guī)對照組。

但在1 h凍融后指數(shù)方面，X/Y性控冷凍精液組顯著低于常規(guī)冷凍精液對照組，主要是由于X/Y性控冷凍精液在分選以及冷凍的過程中經(jīng)歷了長時間的離心、稀釋、染色以及流式細胞儀的激光照射、流式分選的壓力等原因： （1）精子染色的過程以及激光照射的影響，性控冷凍精液制備流程中，染色使得精子損失大量能量，在冷凍解凍后其活力下降十分迅速，1 h后存活指數(shù)自然很低； （2）分離過程中的高倍稀釋作用，由于流式細胞儀本身的原因，分離過程精子將會稀釋到5×105/mL以下。而在以往研究中也證明，高倍稀釋是未成熟的精子在雌性生殖道中運行到達受精地點之前死亡的主要原因之一［9］； （3）高壓作用，目前，高速精子分離一般要用40～50 psi的鞘液壓力，使包含精子的液滴以接近90 km/h的速度從噴嘴高速射出，沖向精子收集管的液面，導致巨大的機械物理損傷。這必然會影響到精子的活力，導致存活時間的降低。

3.3拉布拉多犬分選精子的分裝數(shù)量

對分離冷凍精液的幾個常規(guī)指標檢測結(jié)果初步證明， 本實驗所采用的冷凍程序和方法取得了較好的效果， 解凍后活率和頂體完整率完全符合人工授精（AI）的要求。按照常規(guī)的AI技術(shù)，作為一個輸精量的每一支細管冷凍精液要含有最低約（2～3）×106個精子，但是根據(jù)文獻［10］的實驗研究表明： 在牛的性控冷凍精液AI實驗中，采用子宮深部低劑量人工授精， 分離冷凍精液授精劑量100 萬～ 150 萬個與300 萬個精子妊娠率并無差異。且鑒于犬的精子密度和精液量比牛要低很多，分離速度也有差異，所以參照上述實驗基礎(chǔ)，作者確定了每支細管平均分裝1.5×106個精子，也是符合低性控冷凍精液劑量AI的要求。當然這些分選后的XY性控細管冷凍精液，究竟能否正常妊娠，還需要通過受胎實驗和后代健康評價， 才能決定是否能夠進行大規(guī)模的商業(yè)化生產(chǎn)應用。

綜上所述， 本研究結(jié)果表明利用SX-MOFLO流式細胞儀分離拉布拉多犬的X/Y精子，進行性別控制的研究和應用是可行的， 其分離速度和分離準確率均可以達到較高的水準， 為工作犬精子分離的產(chǎn)業(yè)化奠定了基礎(chǔ)。但鑒于犬的品種多樣性（約400種），且目前犬精子分離方面的研究文獻很少，主要參照牛分離的經(jīng)驗參數(shù)，分離的難度可能將會比奶牛等已經(jīng)性控產(chǎn)業(yè)化的動物要高得多，要想實現(xiàn)高效率和高準確率的工作犬精子分離工作，還需要在種公犬的選擇、精子的染色處理以及流式分選參數(shù)的設(shè)置等方面開展進一步的品種細化、對比分析和研究探討。同時高成本的分選費用，也是限制該技術(shù)應用的另一個因素，犬的精子分離目前僅在部分犬主個人以及科研單位零星實驗研究， 范圍較窄。相信隨著犬低劑量性控冷凍精液輸精技術(shù)水平和流式分選效率的提高， 以XY 精子流式分離為基礎(chǔ)的性別控制技術(shù)，會逐漸成為工作犬的常規(guī)繁育方法。

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Study on Cryopreservation of Flow-cytometrically Sorted X-or Y- chromosome Bearing Sperm on Labrador Retriever

GAO Yi-long， QIN Hai-bin，WEN Hai， QIANG Jing-ning， HE Xing-liang，ZHANG Hui-dong， MA Da-jun， ZHU Qian， LI Gang
（Nanjing Policedog Institute of the Ministry of Public Security，Policedog Technology Key Laboratory of MPS， Nanjing 210012， China）

Objective To investigate the application of flow cytometric technology in separating X or Y sperm from Labrador retriever， and to define a protocol for producing sex-sorted frozen semen. Method The semen were collected from 8 Labrador retrievers by manual stimulation and transported in one hour， and then the semen were separated into X- and Y- chromosome by SX_MOFLO flow cytometric technology， a modified high-speed cell sorter， and finally frozen thawed. Sorted X- or Y-sperm and unsorted sperm as control were reanalyzed and quality assessed. Results The purities of flow sorted sex chromosomes in spermatozoa of three dogs ranged from 89% to 91%. The average separation velocity showed significantly differences between sorted X- sperm （4 260/s） and Y- sperm （3 930/s）. The sex ratio showed significantly differences between frozen- thawed sorted X- or Y- chromosome bearing sperm （89.11%， 90.67%） and the control. The forward progressive motility was not significantly different between sorted sperm and the control. The survive index on sorted sperm was significantly lower （0.251±0.006