周希亞，戚慶煒，郝娜，周京，劉俊濤，邊旭明

（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院，北京 100730）

限制性胎盤嵌合體（CPM）是指胎盤內(nèi)同時(shí)存在染色體正常和異常的細(xì)胞系，而胎兒染色體正常的情況。在早孕期絨毛活檢（CVS）操作中，CPM 的發(fā)生率為1%～2%［1－2］，其中30%～50%的CPM會(huì)在妊娠過(guò)程中丟失胎盤非整倍體細(xì)胞系［3］。而在異常細(xì)胞持續(xù)存在的病例中，CPM可能會(huì)增加不良妊娠結(jié)局的風(fēng)險(xiǎn)。雖然最早的CPM報(bào)道距今已有30余年［1］，但我國(guó)文獻(xiàn)中對(duì)CPM的系統(tǒng)研究及報(bào)告仍很鮮見(jiàn)［4－5］。本文回顧性分析了我院2013年早孕期絨毛活檢中發(fā)現(xiàn)的2例CPM患者，參考近年來(lái)國(guó)內(nèi)外的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，探討CPM的發(fā)生、妊娠結(jié)局、產(chǎn)前咨詢與隨訪處理，及其對(duì)無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)（NIPT）、植入前遺傳學(xué)篩查（PGS）的影響。

資料與方法

一、研究對(duì)象

對(duì)2013年我院產(chǎn)科收治的存在高齡妊娠、胎兒頸部透明層增厚、染色體異常胎兒分娩史的211例妊娠婦女行經(jīng)腹CVS檢查，發(fā)現(xiàn)2例CPM患者，CPM發(fā)生率為0．9%。此2例患者的產(chǎn)前診斷情況見(jiàn)表1。

表1 CPM患者的產(chǎn)前診斷情況

CPM的產(chǎn)前診斷：采用絨毛長(zhǎng)期培養(yǎng)法［4］，進(jìn)行G顯帶核型分析，如發(fā)現(xiàn)絨毛標(biāo)本嵌合，再經(jīng)后續(xù)羊膜腔穿刺或臍血穿刺確認(rèn)，診斷為CPM。

二、研究方法

1．CVS操作：穿刺前認(rèn)真核對(duì)適應(yīng)證、妊娠周數(shù)、子宮大小、有無(wú)穿刺禁忌證等。B超測(cè)量胎兒頭臀長(zhǎng)以核對(duì)孕周，了解有無(wú)胎心，定位胎盤位置，選擇穿刺部位。在超聲引導(dǎo)下，選用雙針套管，將引導(dǎo)套針經(jīng)腹壁及子宮穿刺入胎盤。拔出針芯，將活檢針經(jīng)引導(dǎo)套針內(nèi)送入胎盤絨毛組織。連接含有2～4ml生理鹽水的20ml注射器，以5ml負(fù)壓上下移動(dòng)活檢針吸取絨毛組織。拔針后立即觀察胎盤部位有無(wú)出血及胎心情況。

2．絨毛培養(yǎng)及染色體制備：無(wú)菌條件下，用無(wú)菌生理鹽水將絨毛組織洗凈，去除紅細(xì)胞及蛻膜組織、非絨毛組織。用無(wú)菌剪刀剪碎組織后，加入1ml酶解液（自配，含 0．02%EDTA、0．25% 胰酶和900U／ml的膠原酶），吹打均勻后置于37℃水浴中20～30min，取出后進(jìn)行離心操作，棄上清后，加入Amniomax培養(yǎng)液（GIBCO，美國(guó)）4ml，混勻后置于培養(yǎng)瓶中，37℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3d，至有貼壁細(xì)胞并形成多個(gè)克隆后即采用原位法收獲細(xì)胞。

每個(gè)培養(yǎng)瓶中加入20μl類秋水仙素溶液（GIBCO，美國(guó)），調(diào)整終濃度為25μg／ml，室溫或37℃水浴中作用15min，倒掉液體加入1%枸櫞酸鈉溶液（自配）4ml，室溫或37℃水浴中低滲作用40min，加入1ml 3∶1固定液（甲醇∶冰醋酸＝3∶1，自配）預(yù)固定2min，倒掉液體后，加入1．5ml 3∶1固定液涮壁后倒掉，重新加入固定液4ml作用20min，倒掉液體后再加入固定液4ml作用10min，此步驟重復(fù)一次后將培養(yǎng)瓶上蓋掀掉、甩出液體即可烤片，進(jìn)行染色體分帶染色。

3．羊水細(xì)胞培養(yǎng)及染色體制備：在B超引導(dǎo)下經(jīng)腹抽取羊水20ml，離心后棄上清，每管加入1ml Amniomax培養(yǎng)液后混勻，將細(xì)胞懸液分別加入4個(gè)帶玻片平皿中的蓋玻片上（每個(gè)0．5ml），置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，向每個(gè)平皿中追加1．5ml培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)72h。此后每天顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，觀察到較好的梭形細(xì)胞克隆時(shí)更換培養(yǎng)液，于24h后收獲細(xì)胞。

向每個(gè)平皿中加入20ng／ml秋水仙素12μl，置于37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2h，棄去培養(yǎng)液，加入0．8%枸櫞酸鈉溶液2ml進(jìn)行低滲，37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)20～30min后在相差顯微鏡下觀察，若細(xì)胞透亮渾圓，則緩慢加入3∶1固定液逐步固定。室溫下控干后置于55℃加熱平臺(tái)上烤片，再置于37℃溫箱中過(guò)夜，最后用樹(shù)脂膠將蓋玻片貼在干凈的載玻片上備用。在0．25%胰酶溶液中作用15s后Gi－emsa染色，濾紙吸干多余水分后顯微鏡下觀察。

4．單核苷酸多態(tài)性微陣列分析：采用美國(guó)Affymetrix公司的Cytoscan 750K芯片平臺(tái)進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性微陣列分析。取600μl新生兒外周血采用德國(guó)QIAGEN公司試劑盒及其標(biāo)準(zhǔn)DNA抽提方法提取DNA，并測(cè)定樣本濃度。經(jīng)酶切、連接、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）、PCR產(chǎn)物鑒定、純化、定量、片段化、標(biāo)記、雜交后，對(duì)芯片進(jìn)行洗滌、染色及掃描，得到數(shù)據(jù)經(jīng)Affymetrix自帶軟件轉(zhuǎn)換，并通過(guò)染色體分析軟件ChAS（Chromosome Analysis Suite Software）進(jìn)行分析。

結(jié) 果

一、2例患者的培養(yǎng)及核型分析結(jié)果

患者1絨毛培養(yǎng)及核型分析結(jié)果顯示為15－三體與正常核型的嵌合，羊水細(xì)胞培養(yǎng)及核型分析則僅見(jiàn)1個(gè)核型15－三體?；颊?絨毛培養(yǎng)及核型分析結(jié)果顯示7－三體與正常核型的嵌合，臍血穿刺及核型分析結(jié)果未見(jiàn)異常。

臨床分析認(rèn)為患者1不能除外假性嵌合或低水平的真性嵌合，CPM可能性大；嵌合為單親二倍體的診斷帶來(lái)困難，經(jīng)遺傳咨詢后，該例患者選擇繼續(xù)妊娠?；颊?CPM診斷明確，經(jīng)遺傳咨詢后，選擇繼續(xù)妊娠。

二、CPM的妊娠結(jié)局

患者1于孕38周4d剖宮產(chǎn)1女性活嬰，Apgar評(píng)分10分，新生兒體重3 220g。經(jīng)知情同意后，取新生兒外周血培養(yǎng)并行400～450條帶核型分析，未見(jiàn)異常核型。單核苷酸多態(tài)性微陣列分析結(jié)果為arr（1－22）x2，XYx1。

患者2孕32周時(shí)發(fā)現(xiàn)胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限，定期B超監(jiān)測(cè)胎兒生長(zhǎng)發(fā)育情況，維持妊娠至37周2d剖宮產(chǎn)1男性活嬰，Apgar評(píng)分10分，新生兒體重2 340g，為小于胎齡兒，轉(zhuǎn)兒科處理。取胎盤多點(diǎn)樣本，行320條帶染色體分析，胎盤邊緣100%為47，XY＋7，胎盤中央近胎兒面100%為46，XY，胎盤近臍帶根部母體面細(xì)胞25%為47，XY＋7，75%為46，XY。

討 論

一、CPM的發(fā)生

1983年，Kalousek和Dill發(fā)現(xiàn)，在不明原因?qū)m內(nèi)發(fā)育受限的嬰兒的胎盤中存在CPM［1］。理論上，由于胎盤與胎兒來(lái)自同一受精卵，其染色體核型應(yīng)當(dāng)一致。但是在CPM的病例中，異常染色體核型（數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常）的細(xì)胞系僅存在于胎盤，而胎兒核型正常［2］。

目前，CPM的分類有以下兩種情況，一是根據(jù)發(fā)生機(jī)理，CPM可以分為減數(shù)分裂型及有絲分裂型：減數(shù)分裂型是指受精卵染色體異常（通常為三體），在之后的分裂中，由于“錯(cuò)誤”導(dǎo)致囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中形成胚胎的細(xì)胞丟失了異常染色體，成為46，XN，而其余的異常細(xì)胞被“驅(qū)趕”至滋養(yǎng)細(xì)胞層，這個(gè)過(guò)程被稱為“三體合子挽救”（trisomic zygote rescue）或“胎兒自救”（fetal rescue）；有絲分裂型則是指受精卵為二倍體，異常分裂發(fā)生在胎盤細(xì)胞的前體中。另一種是按照所累及的絨毛細(xì)胞，CPM可以分為3型：Ⅰ型CPM，染色體異常只存在于細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞，因此僅在短期培養(yǎng)后能見(jiàn)到；Ⅱ型CPM，染色體異常局限于絨毛的間質(zhì)核心，只有經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期培養(yǎng)后方可見(jiàn)到；Ⅲ型CPM，染色體異常既存在于細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞，也存在于間質(zhì)核心，短期培養(yǎng)和長(zhǎng)期培養(yǎng)后均可見(jiàn)到［6］。因此對(duì)絨毛同時(shí)進(jìn)行短期培養(yǎng)和長(zhǎng)期培養(yǎng)，可以更準(zhǔn)確地診斷CPM及其分型。本研究中，由于取材量的限制，我院采用的是長(zhǎng)期培養(yǎng)法，故未能對(duì)CPM進(jìn)行準(zhǔn)確分型。有研究報(bào)道，妊娠9～12周時(shí)通過(guò)CVS進(jìn)行產(chǎn)前診斷的病例中，CPM的發(fā)生率約為1%～2%［1－2］，而普通人群中 CPM 的真實(shí)發(fā)生率目前尚不清楚。16－三體是CPM中最常見(jiàn)的非整倍體，其他常見(jiàn)的非整倍體包括2、7、9、15和22號(hào)染色體三體［6］。

二、CPM的妊娠結(jié)局

繼Kalousek和Dill發(fā)現(xiàn)CPM與胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限相關(guān)后，許多學(xué)者希望能證實(shí)這一相關(guān)性，但研究結(jié)果并不一致。有研究發(fā)現(xiàn)CPM與不良妊娠結(jié)局有關(guān)，包括流產(chǎn)、胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限、早產(chǎn)等［7－12］，而另一些研究則未能證實(shí)CPM導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局［13］。有學(xué)者對(duì)不明原因的胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn) CPM 的比例顯著增高［8－10］，但大多數(shù)研究仍集中于早孕期CVS診斷的CPM病例，未發(fā)現(xiàn)分娩孕周、新生兒體重在CPM組與對(duì)照組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。表2展示了部分文獻(xiàn)病例對(duì)照研究的結(jié)果。

表2 CPM對(duì)妊娠結(jié)局影響的部分病例對(duì)照研究

研究結(jié)果的不一致，一方面可能是因?yàn)榇蠖鄶?shù)研究樣本量較小，研究結(jié)果存在一定的偏倚；另一方面可能因?yàn)镃PM對(duì)胚胎及胎兒發(fā)育的影響與諸多因素有關(guān)，包括染色體受累的時(shí)間、染色體異常的類型、受累染色體本身的性質(zhì)，以及足月胎盤的嵌合比例等。有研究報(bào)道，Ⅰ型CPM患者往往出現(xiàn)流產(chǎn)或胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限［7］；有些染色體異常容易造成自然流產(chǎn)，表明這些染色體的CPM可能是減數(shù)分裂型，例如16－三體的 CPM［1］；而另一些染色體的CPM可能是有絲分裂型，例如8－三體的CPM［1］。此外，并非所有早孕期CVS診斷的CPM患者都能維持到妊娠足月，足月胎盤是否仍存在嵌合以及嵌合程度可能與妊娠結(jié)局相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，9號(hào)、16號(hào)染色體三體／二倍體嵌合的CPM患者最易維持至足月［6］。Wilkins－Haug等［14］對(duì)70例胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限的病例進(jìn)行病例對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)，胎兒宮內(nèi)發(fā)育受限的患者其胎盤存在高水平的四倍體嵌合。因此，要想準(zhǔn)確解釋CPM對(duì)妊娠結(jié)局的影響，必須對(duì)足月胎盤進(jìn)行全面地分析。在缺乏胎盤染色體結(jié)果的情況下，很難評(píng)價(jià)CPM與妊娠結(jié)局之間的關(guān)系。對(duì)于不明原因的胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限，建議在分娩時(shí)留取多點(diǎn)胎盤組織進(jìn)行染色體分析。本研究中我院2013年僅收集到的2例CPM患者中，病例2存在胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限，胎盤多點(diǎn)染色體分析證實(shí)了妊娠足月時(shí)胎盤依舊存在嵌合狀態(tài)。

三、CPM的咨詢與隨訪

CVS檢查所取標(biāo)本為早孕期胎盤絨毛，主要為細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞及絨毛間質(zhì)，并非真正的胎兒組織。因此，當(dāng)CVS檢查發(fā)現(xiàn)嵌合時(shí)，首先應(yīng)分析胎兒真性嵌合的可能性。例如，CVS檢查發(fā)現(xiàn)21－三體嵌合，表示胎兒也可能存在21－三體，無(wú)論胎兒本身是否為嵌合體。8、9、12、13、15、18和20－三體的嵌合也存在類似風(fēng)險(xiǎn)。而CVS檢查發(fā)現(xiàn)2、3、5、7、10、11、14、16、17－三體嵌合時(shí)，胎兒核型往往并無(wú)異常［15］。

對(duì)于減數(shù)分裂型CPM，三體受精卵“胎兒自救”過(guò)程中會(huì)丟失掉一條染色體，因此剩余的兩條染色體有可能來(lái)自同一個(gè)親本，即出現(xiàn)單親二體（UPD）。因此，對(duì)于那些可能存在印記基因的染色體，例如當(dāng)發(fā)現(xiàn)涉及5、6、7、9、11、14、15、16號(hào)染色體的 CPM 時(shí)，應(yīng)當(dāng)進(jìn)行 UPD 檢測(cè)［16－17］。

當(dāng)CVS核型分析提示嵌合體結(jié)果時(shí)，遺傳咨詢首先應(yīng)分析CPM的可能性。告知孕婦絕大多數(shù)的嵌合并不意味著胎兒異常，應(yīng)當(dāng)進(jìn)行羊膜腔穿刺或臍血穿刺再次進(jìn)行核型分析；但另一方面也應(yīng)說(shuō)明，即使后續(xù)診斷核型正常，胎兒仍可能存在低水平的嵌合，但不一定影響表型。Stetten等［18］隨訪了29例CPM患者的新生兒，其中2例存在低水平的嵌合。由于CPM與妊娠結(jié)局之間的關(guān)系比較復(fù)雜，妊娠期間難以預(yù)測(cè)，因此，對(duì)CPM患者胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育應(yīng)予以重視，對(duì)宮內(nèi)生長(zhǎng)受限的胎兒應(yīng)加強(qiáng)大腦中動(dòng)脈及臍動(dòng)脈血流的監(jiān)測(cè)，并適時(shí)終止妊娠。產(chǎn)后應(yīng)對(duì)胎盤及新生兒進(jìn)行染色體分析。

四、CPM對(duì)新技術(shù)的挑戰(zhàn)

隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，近年來(lái)，母血胎兒游離DNA被用于胎兒非整倍體檢測(cè)，即無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)技術(shù)（NIPT）。但有研究發(fā)現(xiàn)，CPM是造成NIPT檢測(cè)假陽(yáng)性的重要因素［19－23］。因?yàn)樗^的胎兒游離DNA，并非來(lái)自胎兒，而是來(lái)自胎盤細(xì)胞。胎盤嵌合體的存在，將導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果的發(fā)生，表3列出了CPM導(dǎo)致NIPT檢測(cè)假陽(yáng)性的部分研究（截至2013年）。因此，在獲得NIPT結(jié)果后，建議再行羊膜腔穿刺或臍血穿刺進(jìn)行產(chǎn)前診斷。

表3 CPM導(dǎo)致NIPT檢測(cè)假陽(yáng)性的部分研究

近年來(lái)，植入前遺傳學(xué)篩查技術(shù)（PGS）也逐漸發(fā)展。van Echten－Arends等［24］研究報(bào)道，行 PGS檢測(cè)的卵裂球中，59%是二倍體／非整倍體的嵌合體。Northrop等［25］研究報(bào)道，16%的囊胚為嵌合體。由于植入前高比例的嵌合，在PGS過(guò)程中，采用極體、第3天卵裂球中的單個(gè)細(xì)胞、或者囊胚滋養(yǎng)細(xì)胞層（將來(lái)形成胎盤）的多個(gè)細(xì)胞，都有可能導(dǎo)致PGS認(rèn)為二倍體的胎兒為非整倍體，從而被錯(cuò)誤地排除。

到目前為止，CVS核型分析的嵌合狀態(tài)仍是產(chǎn)前診斷和咨詢中的難點(diǎn)。CPM的發(fā)生率較低，需要通過(guò)羊膜腔穿刺或臍血穿刺、核型分析診斷。對(duì)于某些染色體而言，診斷CPM時(shí)要除外UPD的存在。CPM可能造成NIPT、PGS的假陽(yáng)性結(jié)果，因此，NIPT檢測(cè)陽(yáng)性仍需核型診斷。由于CPM可能對(duì)產(chǎn)前診斷造成上述影響，臨床醫(yī)生應(yīng)當(dāng)重視CPM的存在，加強(qiáng)對(duì)CPM的遺傳咨詢。對(duì)于存在CPM的妊娠，孕期應(yīng)加強(qiáng)對(duì)胎兒生長(zhǎng)發(fā)育的監(jiān)測(cè)，分娩時(shí)留取胎盤多點(diǎn)取材，分別檢測(cè)染色體核型。

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