田翠　林小暉　鄭鵬（濟(jì)南市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，山東濟(jì)南 250001）

梔翹生肌軟膏無菌檢查方法學(xué)探討

田翠林小暉鄭鵬
（濟(jì)南市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，山東濟(jì)南 250001）

目的：建立梔翹生肌軟膏的無菌檢查方法。方法：按照《中國藥典》2010年版附錄的要求，采用薄膜過濾法進(jìn)行無菌檢查，沖洗液用量為每筒300ml，通過接種6株陽性菌進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。結(jié)果：6株陽性菌在試驗(yàn)組與陽性對照組均生長良好。結(jié)論：本法可消除梔翹生肌軟膏的抑菌作用，適用于該制劑的無菌檢查。

梔翹生肌軟膏 無菌檢查 方法學(xué)驗(yàn)證

梔翹生肌軟膏具有清熱解毒、活血化瘀、去腐生肌的作用，適用于燒傷、燙傷、潰瘍、褥瘡、痔瘡及手足干裂，其對于革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均具有抑菌作用。根據(jù)《中國藥典》要求［1］，梔翹生肌軟膏應(yīng)進(jìn)行無菌檢查并建立無菌檢查方法驗(yàn)證。本文按照《中國藥典》要求，采用薄膜過濾法進(jìn)行無菌檢查方法驗(yàn)證［2］，建立梔翹生肌軟膏的無菌檢查標(biāo)準(zhǔn)方法。

1　試驗(yàn)材料與儀器

（1）供試品：梔翹生肌軟膏，批號130526，濟(jì)南市衛(wèi)生科技交流服務(wù)中心。

（2）培養(yǎng)基：營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基、硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，pH7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液，均購自北京三藥科技開發(fā)公司； 0.9%無菌氯化鈉溶液按《中國藥典》2010年版附錄中有關(guān)規(guī)定進(jìn)行配置、分裝和滅菌。

（3）驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)用菌種（第4代））：大腸埃希菌［CMCC（B）44 102］、金黃色葡萄球菌 ［CMCC（B）26 0003］、枯草芽孢桿菌 ［CMCC（B）63 501］、生孢梭菌 ［CMCC（B）64 941］、白色念珠菌［CMCC（F）98 001］、黑曲霉 ［CMCC（F）98 003］，均購自中國食品藥品檢定研究院。

（4）儀器：高壓蒸汽滅菌器，電子天平，生物安全柜，無菌檢測隔離器，集菌培養(yǎng)器，生化培養(yǎng)箱。

2　方法

（1）菌液的制備：取金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、大腸埃希菌的新鮮培養(yǎng)物接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)24小時，取白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁培養(yǎng)基中，23～28℃培養(yǎng)24小時。上述培養(yǎng)物用0.9%的無菌氯化鈉溶液制成小于100cfu/ml的菌懸液，計數(shù)，備用；另將黑曲霉孢子懸液用0.9%無菌氯化鈉溶液制成小于100cfu/ml，計數(shù)，備用。

表1　無菌檢查方法的驗(yàn)證結(jié)果

（2）供試液制備：取梔翹生肌軟膏10盒，每盒以無菌操作方式稱取1g，加至含20ml無菌十四烷酸異丙酯的容器中，充分振搖使供試品溶解，然后加入pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液200ml，振搖5～10分鐘，萃取，靜置，使油水明顯分層，取其水層作為供試液。

（3）方法驗(yàn)證試驗(yàn)組：取“2.2”項(xiàng)下供試液按薄膜過濾法過濾至集菌培養(yǎng)器中，每個濾筒用300ml pH7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液分三次沖洗濾膜，沖洗后加相應(yīng)培養(yǎng)基100ml，然后分別加入小于100cfu/ml的相應(yīng)菌液至濾筒，硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基置30～35℃培養(yǎng)，改良馬丁培養(yǎng)基置23～28℃培養(yǎng)，逐日觀察其結(jié)果。

（4）方法驗(yàn)證陽性對照組：不加供試品，直接用pH7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液，沖洗程序和沖洗量、加培養(yǎng)基、加陽性菌均與“2.3方法驗(yàn)證試驗(yàn)組”項(xiàng)下方法相同。與試驗(yàn)組在相同條件下培養(yǎng)，并逐日觀察其結(jié)果。

（5）供試品的無菌檢查：取“2.2”項(xiàng)下供試液按薄膜過濾法過濾至集菌培養(yǎng)器中，每個濾筒用300ml pH7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液分三次沖洗濾膜，沖洗后加相應(yīng)培養(yǎng)基100ml，陽性組加入金黃色葡萄球菌作為對照，在相應(yīng)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，逐日觀察其結(jié)果。

（6）陰性對照組：取沖洗液按薄膜過濾法過濾，沖洗后每個濾筒中加入相應(yīng)培養(yǎng)基100ml，在相應(yīng)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，逐日觀察其結(jié)果。

3　結(jié)果與分析

3.1無菌檢查方法的驗(yàn)證

按照文中驗(yàn)證的沖洗量和沖洗方法操作，其結(jié)果顯示試驗(yàn)組和陽性對照組培養(yǎng)基均在48h內(nèi)變渾濁，且2組之間在培養(yǎng)時間方面無顯著差異，表明梔翹生肌軟膏在該條件下無抑菌活性或抑菌活性可以忽略不計。無菌檢查方法驗(yàn)證情況，見表1。

3.2供試品的無菌檢查

按“3.2無菌檢查方法的驗(yàn)證”項(xiàng)下的驗(yàn)證方法，用薄膜過濾法對樣品做無菌檢查發(fā)現(xiàn)：陽性對照組培養(yǎng)基在24h內(nèi)變渾濁，培養(yǎng)14d后，陰性對照組和供試品組均無菌生長，培養(yǎng)基澄清。供試品無菌檢查經(jīng)培養(yǎng)14d后的情況，見表2。

表2　供試品無菌檢查結(jié)果

4　討論

（1）梔翹生肌軟膏處方中含有麻油等脂溶性成分，采用十四烷酸異丙脂作為分散劑，增大它的溶解性，使其充分分散溶解。（2）梔翹生肌軟膏含有抑菌成分，與其他品種燙傷膏類似［3］，故未采用直種法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，而采用薄膜過濾法，消除供試品中的抑菌成分后再進(jìn)行無菌檢查。（3）梔翹生肌軟膏系列驗(yàn)證試驗(yàn)表明： 樣品試驗(yàn)組、陽性對照組中各試驗(yàn)菌均能在 48h 內(nèi)生長良好。說明在此實(shí)驗(yàn)條件下所采用的該方法適合于梔翹生肌軟膏的無菌檢查。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）［S］.中國醫(yī)藥科技出版社，2010，附錄XⅢ B：76-79.

［2］中國藥品生物制品檢定所.中國藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范［M］.中國醫(yī)藥科技出版社，2010：337-351.

［3］陳引秀，朱錚.復(fù)方雪蓮燒傷膏無菌檢查法方法學(xué)探討，海峽藥學(xué)，2007，19（9）：45-4.