楊會志，朱小玉，汪　健，孫自敏

臍血移植患者T淋巴細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的特性研究

楊會志，朱小玉，汪健，孫自敏

摘要目的探討異基因臍血移植后外周血T淋巴細(xì)胞免疫功能的特點(diǎn)及規(guī)律。方法11例異基因臍血移植患者分別在移植前、移植后30、60和90 d取外周血，將其中T淋巴細(xì)胞在莫能霉素存在的情況下，體外經(jīng)十四烷酰拂波醇乙脂和離子霉素刺激后，分別進(jìn)行CD4-FITC、CD8-FITC熒光單抗染色和γ-IFN-PE、IL-4-PE熒光單抗胞內(nèi)染色，最后進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。結(jié)果臍血移植后60 d的T淋巴細(xì)胞分泌γ-IFN和IL-4的比率開始增加，90 d后T淋巴細(xì)胞分泌γ-IFN和IL-4的比率增加明顯（P＜0．001）。結(jié)論臍血移植60 d后患者的免疫功能開始恢復(fù)，90 d后免疫功能達(dá)到頂峰，臍血移植是治療急性白血病的一種有效方法。

關(guān)鍵詞異基因臍血移植；T淋巴細(xì)胞；細(xì)胞因子

2015-06-29接收

自從法國Gluckman教授于1988年完成了世界首例異基因臍血移植后，世界各地相繼運(yùn)用該技術(shù)成功治療血液系統(tǒng)惡性病、惡性實(shí)體瘤及遺傳性疾病等多種疾病。臍血移植的安全性和有效性在臨床實(shí)踐中不斷得到驗(yàn)證，與其他類型造血干細(xì)胞移植相比，人體臍血移植的移植物抗宿主?。╣raft-versushost disease，GVHD）發(fā)生率較低且嚴(yán)重程度相對較弱［1］。但臍血移植患者造血重建和免疫恢復(fù)相對延遲，存在一定程度的免疫缺陷狀態(tài)，這都使受者對各種微生物的易感性增加，易患致命性細(xì)菌、霉菌及病毒感染［2］，導(dǎo)致移植失敗。因此研究臍血移植前后外周血T淋巴細(xì)胞免疫活性恢復(fù)情況非常重要。該研究利用流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測臍血移植患者移植前后T淋巴細(xì)胞胞內(nèi)細(xì)胞因子的變化及其分布格局，探討臍血移植后的免疫重建特性，了解可能的發(fā)生機(jī)制。

1　材料與方法

1．1病例資料選取安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院2013年1月～2014年7月11例異基因臍血移植患者，分別取患者移植前以及移植后30、60和90 d的外周血T淋巴細(xì)胞。采用環(huán)胞素＋驍悉預(yù)防GVHD；如發(fā)生GVHD，加用甲強(qiáng)龍干預(yù)，干預(yù)后可抑制過強(qiáng)的免疫功能。

1．2實(shí)驗(yàn)方法采用微量全血法采集標(biāo)本，細(xì)胞因子檢測所需試劑和儀器主要為流式細(xì)胞儀檢測外周血T淋巴細(xì)胞分泌的干擾素（interferon，IFN）和白介素（interleukin，IL）兩種細(xì)胞因子。取0．5 m l經(jīng)肝素抗凝的外周血加入0．5 ml IMDM完全培養(yǎng)基，5%CO2孵育5 h加紅細(xì)胞裂解液5 000 r／min離心1 min，棄上清液備用。分別加抗CD4-FITC、CD8-FITC熒光單抗，4℃避光靜置30 min，用染色緩沖液清洗，加質(zhì)量濃度為1%PFA-PBG每管50μl，4℃過夜。再用穿孔緩沖液洗1次，每管加200μl穿孔液，室溫靜置20 min，5 000 r／min離心1 min棄去上清液。加熒光素標(biāo)記的抗淋巴因子抗體：每管各加200 ng（5～10μl）標(biāo)記物和等量穿孔緩沖液，室溫孵育30 min，分別用穿孔緩沖液洗1次，染色緩沖液洗1次。用質(zhì)量濃度為0．5%PFA-PBS，制備懸浮細(xì)胞，置與流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測。根據(jù)檢測獲取的數(shù)據(jù)，用CBA軟件自動繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線自動計算出樣本中各細(xì)胞因子含量。

1．3統(tǒng)計學(xué)處理使用SPSS 13．0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料描述用±s表示；對重復(fù)測量資料比較采用單因素重復(fù)測量方差分析，γ-IFN和IL-4的變化關(guān)系采用相關(guān)性分析。

2　結(jié)果

2.1異基因臍血移植后T淋巴細(xì)胞免疫系統(tǒng)重建特性T淋巴細(xì)胞分泌的γ-IFN和IL-4經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測（圖1），患者臍血移植前外周血中CD4＋T細(xì)胞和CD8＋T細(xì)胞胞內(nèi)分泌的γ-IFN和IL-4比率分別為（3．97±0．98）、（3．62±0．79）和（2．81± 0．42）、（4．48±1．45）。相對于移植后30 d，移植后60、90 d的CD4＋T細(xì)胞和CD8＋T細(xì)胞胞內(nèi)分泌的γ-IFN和IL-4均逐漸增高，Linear趨勢檢驗(yàn)結(jié)果顯示差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．001）。

2.2γ-IFN和IL-4變化的相關(guān)性分析經(jīng)相關(guān)分析，異基因臍血移植患者γ-IFN和IL-4變化呈正相關(guān)性（r＝0．789，P＜0．001）。見圖2。

3　討論

異基因造血干細(xì)胞移植是現(xiàn)今治愈血液病最安全有效的方法。由于人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）嚴(yán)格相合的血緣及非血緣骨髓供者嚴(yán)重不足而極大地限制了移植的廣泛開展。而感染和免疫重建是影響移植療效的另一個主要因素，感染相關(guān)的死亡大多發(fā)生于移植后3～4個月。故應(yīng)密切監(jiān)測免疫重建進(jìn)程，并根據(jù)檢測結(jié)果及時調(diào)整治療方案，從而提高人體臍血移植的成功率。免疫重建過程中的細(xì)胞因子的檢測方法較多，而流式細(xì)胞儀雙標(biāo)記法檢測是目前國內(nèi)外最經(jīng)典方法，不僅可以準(zhǔn)確地反映單一細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的能力，而且又能反映具有分泌細(xì)胞因子能力的特定細(xì)胞群及細(xì)胞數(shù)量，是目前國際上常用的測定T淋巴細(xì)胞功能亞群、活化狀態(tài)、分化情況的一種先進(jìn)的方法［3］。

表1　臍血移植患者移植前后胞內(nèi)　γ-IFN和　IL-4的變化情況（n＝11）

T淋巴細(xì)胞亞群繁多，功能各異，按其胞內(nèi)分泌的細(xì)胞因子譜的不同至少可分為兩種功能截然不同的亞群，即Th1和Th2。Th1亞群主要分泌IL-2、IL-12、TNF-α和IFN-γ；Th2亞群主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等。在Th1亞群中以IFN-γ分泌為主要特征，參與細(xì)胞免疫反應(yīng)，是引發(fā)GVHD的主要細(xì)胞亞群，在造成GVHD的“細(xì)胞因子風(fēng)暴”中，Th1分泌的細(xì)胞因子起著關(guān)鍵作用。而Th2亞群中以IL-4的分泌最富代表性，主要參與體液免疫應(yīng)答。Th1和Th2亞群之間還存在拮抗作用，分泌的細(xì)胞因子均可刺激自身的分化與發(fā)展而抑制對方的分化與發(fā)展［4-6］。

白血病患者因?yàn)楸旧砻庖呤軗p，功能低下，導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞功能降低，本實(shí)驗(yàn)也表明，臍血移植前T淋巴細(xì)胞分泌的γ-IFN和IL-4較正常人弱［7］，顯示白血病患者自身的T淋巴細(xì)胞免疫功能下降。移植后30 d，T淋巴細(xì)胞分泌γ-IFN和IL-4的比率較移植前繼續(xù)下降，顯示患者此時處于免疫功能缺乏狀態(tài)。臍血移植后60 d后T淋巴細(xì)胞分泌γ-IFN 和IL-4的比率開始增加，顯示T淋巴細(xì)胞免疫功能開始恢復(fù)，特別是Th2亞群細(xì)胞恢復(fù)較快。90 d后T淋巴細(xì)胞分泌γ-IFN和IL-4的比率增加明顯，本次研究顯示，IFN-γ和IL-4的增加變化呈正相關(guān)性，提示Th1和Th2免疫功能同步恢復(fù)。但是γ-IFN的分泌量較IL-4的分泌量增加顯著，顯示一種優(yōu)勢明顯的細(xì)胞因子分泌狀態(tài)。由于90 d后T淋巴細(xì)胞的這種功能增加可能是GVHD發(fā)生的原因之一，這與本實(shí)驗(yàn)11例病例中有2例發(fā)生GVHD相吻合。本實(shí)驗(yàn)觀察的病例數(shù)較少，結(jié)果可能有偏移，應(yīng)加強(qiáng)相關(guān)病例數(shù)研究。

參考文獻(xiàn)

［1］Grewal SS，Barker JN，Davies SM，etal．Unrelated donor hematopoietic cell transplantation：marrow or umbilical cord blood［J］．Blood，2003，101（11）：4233-44．

［2］Bowers E，TamakiS，Coward A，et al．Differing functional recovery of donor-derived immune cells after purified haploidentical and fullymismat ched hematopoietic stem cell transplantation in mice ［J］．Exp Hematol，2000，28（12）：1481-9．

［3］Boesch M，Zeimet A G，Reimer D，et al．The side population of ovarian cancer cells defines a heterogeneous compartment exhibiting stem cell characteristics［J］．Oncotarget，2014，5（16）：7027-39．

［4］Nishioka C，Ikezoe T，Yang J，et al．The combination of IκB kinase βinhibitor and everolimusmodulates expression of interleukin-10 in human T-cell lymphotropic virus type-1-infected T cells［J］．Immunology，2013，138（3）：216-27．

［5］Liu J，He C，Zhou H，et al．Effects of TLR4 onβ2-glycoprotein I-induced bone marrow-derived dendritic cellsmaturation［J］．Cell Immunol，2014，290（2）：226-32．

［6］Hardtke-Wolenski M，Kraus L，Schmetz C，et al．Exchange of cytosolic content between T cells and tumor cells activates CD4 T cells and impedes cancer growth［J］．PLoSOne，2013，8（10）：e78558．

［7］楊會志，汪健，孫自敏．急性髓系白血病患者T淋巴細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá)特性［J］．中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2007，15（6）：1161-4．

The characteristics of T lymphocyte cytokine in the cord blood transp lantation patients

Yang Huizhi，Zhu Xiaoyu，Wang Jian，et al
（Dept of Hematology，The Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei230001）

AbstractObjectiveTo evaluate characteristics of T-lymphocyte immunologic function and reconstitution after allo-gene cord blood transplantation．MethodsTo peripheral blood from 11 human cord blood at30，60 and 90 days after cord blood transplantation，the T-lymphocytes with phorbol 12-myristate 13-acetate and ionomycin in the presence ofmonensin．CD4＋and CD8＋Tcellswere analyzed forγ-IFN and IL-4 intrecellular production by flow cytometry．ResultsThe rate ofγ-IFN and IL-4 from T lymphocytes began to increase at60 days after the transplantation，and the rate ofγ-IFN and IL-4 increased significantly at90 days after the transplantation（P＜0．001）．ConclusionThe immune function begins to recover at 60 days after the Cord blood transplantation，the immune function peaks after 90 days．Cord blood transplantation is effective for the acute leukemia trerapy．

Key wordsallo-gene cord blood transplantation；T-lymphocytes；cytokines

中圖分類號R 55

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號1000-1492（2015）11-1680-04

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（編號：31101006）

作者單位：安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院血液科，合肥230001

作者簡介：楊會志，男，副主任醫(yī)師，責(zé)任作者，E-mail：yanghz69＠sina．com