胡　萍，朱永明，，謝如鋒，王志成

抗霉素A誘導血小板凋亡的分子機制研究

胡萍1，朱永明1，2，謝如鋒2，王志成3

摘要目的探討抗霉素A（AMA）誘導血小板凋亡及其分子機制。方法取健康志愿者單采血小板，離心洗滌得到洗滌血小板，將洗滌血小板與不同濃度的AMA孵育后，流式細胞術(shù)檢測線粒體跨膜電位（ΔΨm）去極化、磷脂酰絲氨酸（PS）暴露、細胞內(nèi)活性氧（ROS）、線粒體ROS、P-選擇素表達和整合素αⅡbβ3活化；Western blot法檢測半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）的活化。在抑制試驗中，先將洗滌血小板與線粒體靶向的ROS拮抗劑Mito-TEMPO預孵育，然后再與AMA孵育，流式細胞術(shù)檢測相關(guān)凋亡指標。結(jié)果AMA劑量依賴性誘導血小板ΔΨm去極化、PS暴露、細胞內(nèi)ROS和線粒體ROS升高以及Caspase-3活化；但是AMA不能誘導血小板活化。線粒體靶向的ROS拮抗劑抑制AMA誘導的血小板ΔΨm去極化、PS暴露、Caspase-3活化以及線粒體ROS的生成。結(jié)論AMA能夠誘導血小板發(fā)生凋亡，線粒體ROS可能在AMA誘導的血小板凋亡過程中起重要作用。

關(guān)鍵詞血小板；凋亡；抗霉素A；線粒體；活性氧

2015-06-18接收

2上海市血液中心血液工程研究室，上海200051

3復旦大學附屬華山醫(yī)院檢驗科，上海200040

朱永明，男，研究員，責任作者，E-mail：zhuyongming＠sbc．org．cn；

王志成，男，助理研究員，責任作者，E-mail：ahwzc＠126．com

抗霉素A（Antimycin A，AMA）是一類由鏈霉菌產(chǎn)生的大環(huán)內(nèi)脂類天然抗生素，是一種線粒體抑制劑，能夠抑制線粒體電子傳遞鏈細胞色素b和細胞色素c之間的電子傳遞，從而導致線粒體內(nèi)膜質(zhì)子梯度的崩潰，破壞線粒體跨膜電位（mitochondrial transmembrane potential，ΔΨm），同時，這種抑制作用也會引起細胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）的積累［1］。有證據(jù)［2-3］表明ROS的存在和ΔΨm的去極化都可以使線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）開放，這與類似細胞色素c等凋亡前分子釋放到胞質(zhì)從而發(fā)生一系列凋亡事件相關(guān)。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)AMA可以誘導肺癌細胞、內(nèi)皮細胞、近腎小球細胞、HeLa細胞等多種細胞［1，4］發(fā)生凋亡，并且伴隨胞內(nèi)ROS濃度的升高。生理誘導劑和化學化合物都可以引起血小板的凋亡［5-6］，并且在體外血小板保存中，血小板會發(fā)生凋亡，這是血小板儲存損傷（PSL）重要原因之一［7］，也是當今血小板保存面臨的一個科學難題。在生理狀態(tài)下，在控制循環(huán)血小板的數(shù)量和功能以及血小板相關(guān)性出血疾病中，血小板的凋亡可能發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。該實驗主要研究AMA是否能誘導人類血小板凋亡，并探究線粒體ROS在AMA誘導的血小板凋亡過程中的作用，從而進一步了解血小板的凋亡機制，為改善血小板的質(zhì)量、延緩血小板凋亡的發(fā)生提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1．1主要抗體和試劑AMA、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、四甲基羅丹明乙酯（tetramethylrhodaminemethyl ester，TMRE）、N-乙?；腚装彼幔∟-acetylcysteine，NAC）購自美國Sigma公司；細胞內(nèi)ROS熒光染料CellROX Deep Red購自美國Life technologies公司；線粒體ROS熒光染料MitoSOXTM Red購自美國Invitrogen公司；線粒體ROS拮抗劑Mito-TEMPO購自瑞士Enzo Life Sciences公司；抗體PE-CD62P、抗體 FITC PAC-1、FITC Annexin V凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司；Caspase-3抗體購自美國Santa Cruz公司。

1．2洗滌血小板制備新鮮健康獻血者單采血小板以2 950 r／min離心20 min后棄上清液，用CGS緩沖液（123 mmol／L氯化鈉，33 mmol／L D-葡萄糖，13 mmol／L枸櫞酸鈉，pH＝6．5）洗滌血小板2次，2 950 r／min離心20 min，再用改良的臺氏緩沖液（modified tyrode buffer，MTB）（2．5 mmol／L HEPES，150mmol／L氯化鈉，2．5mmol／L氯化鉀，12mmol／L碳酸氫鈉，1 mmol／L氯化鈣，1 mmol／L氯化鎂，5．5 mmol／L D-葡萄糖，pH＝7．4）重懸，根據(jù)血小板計數(shù)情況，調(diào)整血小板濃度為3×108個／ml。洗滌的血小板在室溫靜置1～2 h，恢復到靜息狀態(tài)備用。

1.3線粒體跨膜電位（ΔΨm）去極化檢測洗滌血小板（3×108個／ml）與不同濃度的AMA（5、20、80 μmol／L）混勻，37℃避光預處理30 min，DMSO作為AMA的溶液對照組。然后將TMRE加入到預處理的血小板中，使終濃度為100 nmol／L，37℃避光反應(yīng)20 min，用流式細胞術(shù)檢測。

1.4磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）暴露檢測洗滌血小板（3×108個／m l）與不同濃度的AMA（20、40、80μmol／L）混勻，37℃避光預處理30 min，DMSO作為AMA的溶液對照組。將預處理后血小板稀釋至終濃度為5×107個／ml，按Annexin V結(jié)合緩沖液∶處理血小板∶Annexin V-FITC的濃度為50∶10∶2比例混勻，室溫避光反應(yīng)15 min，用流式細胞術(shù)檢測。

1.5細胞內(nèi)ROS和線粒體ROS的檢測洗滌血小板（3×108個／ml）分別裝載CellROX Deep Red （10μmol／L）和MitoSOXTMRed（10μmol／L），37℃避光孵育30min和15min，用MTB液洗3次。預裝載的血小板與不同濃度的AMA（20、40、80μmol／L）混勻，DMSO作為AMA的溶液對照組。37℃避光預處理30 min后，用流式細胞術(shù)檢測。

1．6血小板表面活化指標檢測洗滌血小板（3× 108個／m l）與不同濃度的AMA（20、40、80μmol／L）混勻，DMSO作為AMA的溶液對照組，37℃避光預處理30 min。P-選擇素表達的檢測：將PE-CD62P及同型對照PE-IgG1分別加入到預處理的血小板中；整合蛋白αIIβ3的活化形式檢測：將FITC-PAC-1及同型對照FITC-IGMκ分別加入到預處理的血小板中，常溫避光反應(yīng)20 min，用流式細胞術(shù)檢測。

1．7抑制試驗洗滌血小板（3×108個／m l）先與Mito-TEMPO（10μmol／L）或溶劑對照37℃避光孵育15 min，然后再用AMA處理血小板，用流式細胞術(shù)檢測相關(guān)指標。

1.8Western blot法檢測洗滌血小板（3×108個／m l）與不同濃度的AMA（20、40、80μmol／L）混勻，DMSO作為AMA的溶液對照組，37℃避光預處理30 min。然后加入等體積的裂解液（含8%2-巰基乙醇）在冰上吹打抽提蛋白，煮沸5 min，離心取上清液。樣品進行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜，用抗Caspase-3單克隆抗體進行處理，膠片X光曝光顯色。

1．9統(tǒng)計學處理采用 SPSS 19．0統(tǒng)計軟件進行分析，結(jié)果均以±s表示，兩組間的比較采用配對t檢驗，多組均數(shù)的比較采用方差分析。

2　結(jié)果

2.1AMA對血小板ΔΨm的影響AMA劑量依賴性誘導血小板ΔΨm去極化，見圖1。

2.2AMA對血小板PS暴露的影響AMA劑量依賴性誘導血小板PS暴露，見圖2。

2.3AMA對血小板細胞內(nèi)ROS和線粒體ROS的影響AMA劑量依賴性誘導血小板細胞內(nèi)ROS和線粒體ROS的生成，見圖3。

2.4AMA誘導Caspase-3活化AMA濃度依賴地誘導Caspase-3產(chǎn)生17 ku活化片段，見圖4。

2.5AMA對血小板活化的影響與DMSO組相比，AMA并不能明顯引起血小板表面P-選擇素的表達和整合素αⅡbβ3活化，見圖5。

2.6抑制線粒體ROS對AMA誘導的血小板凋亡的影響Mito-TEMPO可以有效降低血小板線粒體ROS的水平（圖6A）。對于ΔΨm的去極化（圖6B）和PS暴露（圖6C）也具有明顯抑制作用。

3　討論

研究［8］顯示血小板和有核細胞一樣，其凋亡也可分為外源途徑及線粒體介導的內(nèi)源途徑，其中線粒體途徑在血小板凋亡中起主要調(diào)控作用。血小板在不同誘導劑的作用下發(fā)生凋亡主要是通過線粒體途徑，其凋亡的早期表現(xiàn)即ΔΨm的去極化，Caspase-3活化是線粒體凋亡途徑的最終通路，Casepase-3通常以32 ku的酶原形式存在于胞質(zhì)，當被激活時會產(chǎn)生17 ku的活化片段［9］。本研究證實，AMA存在劑量依賴誘導血小板ΔΨm去極化和Caspase-3活化，這表明AMA誘導血小板凋亡主要是通過線粒體途徑。血小板在強和弱誘導劑的作用下發(fā)生凋亡的共同特點是ΔΨm的去極化和Caspase-3的活化，但是只有在強誘導劑的作用下血小板才會發(fā)生PS暴露［10］。本研究證實，AMA存在劑量依賴誘導血小板PS暴露，表明AMA是血小板強誘導劑。血小板凋亡和血小板活化都可以引起血小板表面PS暴露［6，10］。為了排除AMA誘導血小板活化的可能性，從而檢測AMA對血小板的活化作用。血小板表面P-選擇素的表達率和和整合素αⅡbβ3活化率是血小板活化的顯著表現(xiàn)之一，通過檢測AMA處理后的血小板表面P-選擇素的表達和PAC-1的結(jié)合，排除了AMA誘導血小板活化的可能。

ROS包括超氧陰離子、羥自由基和H2O2等，細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生與清除之間保持動態(tài)平衡［11］。AMA主要是抑制線粒體電子傳遞鏈的作用，這種抑制作用可以破壞ΔΨm，從而打破細胞內(nèi)氧化還原平衡［1］。已有報道［1，4，12］AMA誘導肝臟細胞和人類肺癌細胞A549凋亡中細胞內(nèi)H2O2的積累發(fā)揮重要作用，另外，在人類肺上皮細胞中，AMA可以引起超氧陰離子的升高。為了驗證線粒體ROS在AMA誘導的血小板凋亡過程中作用，分別檢測AMA處理后的血小板細胞內(nèi)和線粒體內(nèi)的ROS水平變化，結(jié)果顯示AMA劑量依賴地誘導血小板細胞內(nèi)和線粒體ROS濃度升高。為了進一步證實 ROS在AMA誘導血小板凋亡中的作用，用線粒體ROS靶向拮抗劑Mito-TEMPO和抗氧化劑 NAC對血小板進行預處理，結(jié)果顯示Mito-TEMPO可以明顯抑制其誘導的凋亡，NAC也有部分抑制作用，但是效果并不十分明顯（結(jié)果未顯示）。抑制試驗進一步證實線粒體ROS參與了AMA誘導血小板凋亡的調(diào)控。

在有核細胞中，線粒體凋亡通路是最普遍的凋亡機制，MPTP貫穿線粒體內(nèi)膜和外膜，MPTP的開放是啟動線粒體凋亡通路的重要步驟［2］。MPTP的形成和開放與ROS有著密切的關(guān)系：在人乳腺癌細胞中，MPTP形成的決定性因素包括線粒體鈣離子濃度和ROS的生成［12］，但是在缺血性再灌注肌細胞中，僅僅ROS濃度升高便可啟動MPTP的形成［13］。血小板線粒體中也存在MPTP，并控制著凋亡的發(fā)生。受到強烈刺激的血小板的胞外鈣離子的濃度的升高可以誘導ROS的生成，從而增強MPTP的形成和PS的外翻［14-15］。本研究證實AMA能夠劑量依賴性地誘導血小板線粒體ROS濃度升高，提示AMA誘導血小板凋亡可能是通過引起線粒體ROS濃度的增加，并在很大程度上影響MPTP不可逆性開放，從而調(diào)控著血小板凋亡的發(fā)生。

血小板凋亡與機體的多種生理功能及病理過程密切相關(guān)，凋亡可能是血小板在體內(nèi)清除的重要途徑之一。本研究顯示AMA作為一種線粒體ROS促進劑可以有效地誘導血小板凋亡，并且本研究結(jié)果表明線粒體ROS可能在血小板凋亡中起著至關(guān)重要的作用。這不僅有助于進一步了解血小板的凋亡機制、明確MPTP在血小板凋亡中起的作用，而且在今后的研究中可以把AMA作為一種 ROS促進劑從血小板代謝、形態(tài)、活化和凋亡以及功能等方面，深入研究線粒體 ROS在血小板儲存損傷中發(fā)揮的重要作用，進一步認識儲存血小板發(fā)生凋亡的分子機制，為延長血小板保存時間、提高血小板質(zhì)量提供理論依據(jù)。

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Study ofmolecular mechanisms on platelet apoptosis induced by antimycin A

Hu Ping1，Zhu Yongming1，2，Xie Rufeng2，et al
（1Institute of Life Science，East China Normal University，Shanghai200062；2Shanghai Blood Center Engineering Laboratory，Shanghai200051）

AbstractObjectiveTo investigate the effects andmolecularmechanism of plateletapoptosis induced by Antimycin A（AMA）．MethodsWashed healthy volunteers platelets were pre-incubated with different concentration AMA，and then depolarization ofmitochondrialmembrane potential（ΔΨm），phosphatidylserine（PS）externalization assay，the surface expression of P-selectin，the activation of integrinαIIβ3 and the production of intracellularreactive oxygen species（ROS），mitochondrial ROSwere detected by flow cytometry．The activation of Caspase-3 was analyzed by Western blot．In inhibition experiment，washed platelets were pre-incubated mitochondrial ROS targeted antagonists Mito-TEMPO，and then stimulated with different concentration AMA．The apoptosis associated indicatorswere detected by flow cytometry．ResultsAMA dose-dependently induces depolarization ofΔΨm，PS exposure，Caspase-3 activation，and the production of intracellular ROSandmitochondrialROS，but AMA does not induce platelet activation．Mito-TEMPO effectively reduces the depolarization ofΔΨm，PS exposure and the production ofmitochondrial ROSwhich induced by the AMA．ConclusionAMA can induce platelet apoptosis，and mitochondria ROSmay play an important role in the platelets apoptosis induced by the AMA．

Key wordsplatelets；apoptosis；antimycin A；mitochondria；reactive oxygen species

中圖分類號R 331．1＋43

文獻標志碼A

文章編號1000-1492（2015）11-1588-06

基金項目：國家自然科學基金（編號：81270650）；上海市自然科學基金資助項目（編號：12ZR1429900）

作者單位：1華東師范大學生命科學學院，上海200062

作者簡介：胡萍，女，碩士研究生；