何漢文，王　蔥，杜博易，吳　璇，于　莉，汪旻旻，黃升海

TLR7在呼吸道合胞病毒感染A549細胞誘導I型干擾素中的作用

何漢文1，王蔥2，杜博易2，吳璇1，于莉1，汪旻旻1，黃升海1

摘要目的探討Toll樣受體7（TLR7）在呼吸道合胞病毒（RSV）感染A549細胞誘導產(chǎn)生I型干擾素（IFN）抗病毒免疫反應中的作用。方法實驗分正常對照組、RSV感染組、TLR7 siRNA沉默組，分別于感染的4、8、12、24 h后收集各組細胞以及培養(yǎng)上清液。TLR7 siRNA通過瞬時轉染A549細胞，半定量RT-PCR法檢測TLR7基因沉默效果；TRIzol試劑提取細胞總RNA，檢測TLR7、干擾素調(diào)節(jié)因子7（IRF7）、IFN-α、IFN-β的mRNA表達量變化；通過Western blot法檢測TLR7蛋白表達量；ELISA法檢測感染不同時間點A549細胞培養(yǎng)上清液中IFNα／β含量的變化。結果①轉染24 h后TLR7 siRNA-2有效抑制TLR7mRNA表達；②RSV感染A549細胞后，TLR7、IRF7、IFN-α／β的 mRNA以及 TLR7蛋白的表達量均升高，并與RSV感染之間存在時間依賴性關系；沉默TLR7后，TLR7、IRF7、IFN-α／β的mRNA以及TLR7蛋白的表達量較感染組均有明顯下降；③RSV感染A549細胞后，明顯上調(diào)細胞培養(yǎng)上清液中IFN-α／β的水平，TLR7 siRNA沉默組IFN-α／β的表達水平較RSV感染組均下降，差異有統(tǒng)計學意義，且IFN-α的表達量下調(diào)更為顯著。結論RSV感染A549細胞后，TLR7被活化能夠誘導產(chǎn)生I型IFN，發(fā)揮抗病毒作用，且TLR7誘導產(chǎn)生的I型IFN以IFN-α為主。

關鍵詞呼吸道合胞病毒；A549細胞；Toll樣受體7；siRNA；I型干擾素

2015-06-20接收

黃升海，男，教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：huangshh68＠aliyun．com

呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）是一種有包膜單負鏈的RNA病毒，屬于副黏病毒科肺炎病毒屬［1］，是世界范圍內(nèi)嬰幼兒嚴重下呼吸道感染（包括肺炎和細支氣管炎）的最常見病原體［2-3］。目前RSV感染的病理機制尚不明確，迄今仍無理想的治療藥物和疫苗。Toll樣受體7（Tolllike receptor 7，TLR7）可通過識別病毒的單股RNA而活化細胞［4-5］，誘導I型干擾素（interferon，IFN）產(chǎn)生，活化核轉錄因子κB（nuclear factor ofκB，NF-κB）的表達，從而介導免疫炎癥反應。本實驗通過RNAi沉默TLR7表達，研究RSV感染A549細胞后TLR7的活化，探討其活化所介導的I型IFN產(chǎn)生機制及其抗病毒作用，為臨床RSV感染的預防與治療提供思路。

1　材料與方法

1．1材料

1．1．1細胞和病毒人肺泡Ⅱ型上皮細胞A549、人喉癌上皮細胞（Hep-2）和RSV-Long株（國際標準株）均由安徽醫(yī)科大學微生物學教研室保存。

1．1．2主要試劑DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季清公司）；TRIzol試劑（美國Invitrogen公司）；TLR7 siRNA（上海百奧邁科生物科技有限公司）；逆轉錄試劑盒（美國Fermentas公司）；IFN-α／β酶聯(lián)檢測試劑盒（深圳欣博盛生物科技有限公司）；抗TLR7抗體、抗β-actin（美國Santa Cruz公司）；HRP-羊抗兔IgG（碧云天生物技術有限公司）；其他試劑為市售分析純。

1．2方法

1．2．1病毒感染量測定將凍存的RSV-Long株與37℃水浴復蘇后經(jīng)Hep-2細胞增殖，病變達80%～90%時收獲病毒，-80℃保存?zhèn)溆??？瞻咝问皆囼灒╬laque forming unit，PFU）檢測病毒增殖滴度為1．55×108／ml。

1．2．2細胞培養(yǎng)與實驗分組將凍存的A549細胞復蘇后接種于細胞瓶中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞長至80%～90%用于實驗。實驗分正常對照組（同等條件下培養(yǎng)的未感染病毒細胞）、RSV感染組、TLR7 siRNA沉默組（TLR7 siRNA ＋RSV組）。

1．2．3細胞轉染條件的優(yōu)化與轉染取對數(shù)生長期的A549細胞，用胰蛋白酶消化，制備成單細胞懸液接種于96孔板，用不含抗生素的含血清的DMEM培養(yǎng)。待細胞長至80%時，棄去含血清的細胞培養(yǎng)液，用預冷的PBS洗滌3次，用無血清無抗生素的DMEM培養(yǎng)液進行轉染，Lipofectamine 2000與帶有FAM標記的siRNA分別用opti-MEM進行稀釋，孵育20 min后，形成Lipofectamine2000-siRNA復合物，均勻加入培養(yǎng)基，放入CO2孵箱中培養(yǎng)，6 h后更換完全培養(yǎng)基。轉染24 h后，將細胞置于熒光顯微鏡下觀察轉染效率，用于優(yōu)化細胞的轉染條件。

以TLR7為靶向沉默基因，設計并合成3條TLR7 siRNA干擾序列以及1條siRNA空白對照序列，取轉染24 h后細胞，提取細胞總RNA，利用RTPCR法檢測TLR7 mRNA的表達，篩選出能有效抑制TLR7基因的干擾序列，以期達到阻斷TLR7信號通路的目的。

1．2．4TLR7、IRF7、IFN-α、IFN-β的mRNA水平檢測收集細胞，按TRIzol試劑盒說明書提取細胞總RNA，分光光度計法檢測RNA的純度與濃度，取1 μg總RNA按逆轉試劑盒說明書程序進行：42℃45 min，95℃5 min，4℃5 min合成cDNA。反應結束后，將逆轉錄結果體系按1∶5稀釋，進行PCR擴增，以人β-actin的mRNA表達作為內(nèi)參。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1．5%瓊脂糖凝膠電泳分析，經(jīng)凝膠成像分析儀掃描拍照后，用Labworks軟件分析測定條帶的灰度值，以目的基因與β-actin的比值對mRNA表達水平進行半定量分析。各基因的引物序列和擴增片斷長度見表1，各基因的PCR反應條件：94℃預變性5 min，94℃變性40 s，退火時間為45 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)，TLR7、IRF7、IFN-α、IFN-β、βactin退火溫度為：55℃、55℃、57．7℃、57℃、49．4℃。

表1　人各基因的引物序列和擴增片段大小

1．2．5不同感染條件下各組細胞不同時間點TLR7蛋白的表達分別收集正常對照組和不同感染條件各組不同時間點的A549細胞并進行裂解，冰上孵育30 min后，離心收集上清液，煮沸5 min，進行SDS-PAGE電泳；然后將蛋白轉移至PVDF膜，轉膜后用5%的脫脂奶粉，室溫下封閉1 h，分別加入TLR7（1∶500）、β-actin（1∶500）一抗，4℃孵育過夜。洗膜后，ECL顯影后曝光并顯影，用Labworks軟件分析測定灰度值，進行分析。

1．2．6不同條件下細胞培養(yǎng)上清液中IFN-α／β的表達收集各實驗組細胞培養(yǎng)上清液，離心后去除沉淀，分裝EP管，-80℃保存，應避免反復凍融。嚴格按照ELSIA試劑盒說明書進行操作，酶標儀讀取吸光度值，計算出IFN-α／β的表達水平。

1．3統(tǒng)計學處理采用SPSS 19．0軟件進行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，多個樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。

2　結果

2．1轉染效率的檢測利用熒光顯微鏡觀察FAM標記的siRNA轉染A549細胞，轉染24 h后細胞中出現(xiàn)明顯的FAM標記的綠色熒光，普通光源下的A549細胞對比熒光明場下的綠色熒光細胞，siRNA的轉染效率為90%（圖1），初步認為設計合成的FAM-siRNA已成功轉入細胞內(nèi)。

2.2TLR7 siRNA轉染A549細胞后TLR7mRNA表達情況TLR7 siRNA-1、TLR7 siRNA-2、TLR7 siRNA-3和siRNA空白對照分別轉染A549細胞，24 h后對TLR7基因進行RT-PCR檢測結果顯示，TLR7 siRNA-2組較其他組抑制作用最強，可以更有效地抑制TLR7 mRNA的表達，后續(xù)轉染實驗選擇TLR7 siRNA-2為最佳的轉染序列（圖2）。

2.3RSV感染不同時間點各組TLR7 m RNA的表達RT-PCR測定結果顯示，正常對照組的A549細胞的 TLR7表達很低；在RSV感染組TLR7 mRNA的表達量隨時間延長而逐漸增加，有時間依賴性；與正常對照組比較，感染4 h后A549細胞中的TLR7 mRNA轉錄水平逐漸升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．01）。在TLR7 siRNA沉默組，TLR7 mRNA的表達水平雖有所增加，但較RSV感染組同時間點表達量顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（F＝35．08，P＜0．01），見圖3。

2.4不同時間點各組IRF7 mRNA的表達正常對照組A549細胞中的IRF7 mRNA表達量較低；與正常對照組比較，RSV感染組IRF7mRNA表達量可隨時間延長呈上調(diào)趨勢；在RSV感染A549細胞4 h后，各時間點IRF7 mRNA表達水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．01）；在TLR7 siRNA沉默組，IRF7 mRNA表達盡管有上升的趨勢，但較RSV組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（F＝29．91，P＜0．01），見圖4。

2.5IFN-αmRNA在各組不同時間點的表達RT-PCR測定結果顯示，正常對照組中IFN-αmRNA的表達量很低；RSV感染組與正常對照組比較，IFN-αmRNA的表達量升高且有時間相關性，8 h后IFN-αmRNA表達水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．01）；在 TLR7 siRNA沉默組，IFN-αmRNA的表達較RSV感染組的表達量顯著下降，8 h后降低，差異有統(tǒng)計學意義（F＝11．46，P＜0．05）。見圖5。

2.6IFN-βm RNA在各組不同時間點的表達正常對照組的A549細胞的IFN-βmRNA表達基線很低；RSV感染組IFN-βmRNA的表達量升高且具有時間依賴性。RSV感染4 h后，IFN-βmRNA表達水平均高于正常對照組，各時間點差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）；在TLR7 siRNA沉默組，經(jīng)TLR7 siRNA轉染后，細胞表達IFN-βmRNA的量雖較正常對照組高，但與RSV感染組各時間點比較明顯下降，在轉染8 h后IFN-βmRNA的表達量降低，差異有統(tǒng)計學意義（F＝11．72，P＜0．05）。見圖6。

2.7TLR7在各組不同時間點的蛋白水平變化TLR7蛋白在正常A549細胞中表達非常低，經(jīng)RSV感染后，TLR7蛋白的表達量隨著感染時間的增加，不斷上調(diào)（P＜0．01），RSV感染A549細胞后，不同感染時間點TLR7蛋白表達量均高于正常對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0．01）；在TLR7 siRNA沉默組，各時間點均檢測到TLR7蛋白表達量，但較RSV感染組明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（F＝26．90，P＜0．01）。見圖7。

2.8不同條件下細胞培養(yǎng)上清液中IFN-α／β水平的改變ELSIA法檢測A549細胞培養(yǎng)上清液中IFN-α／β的表達水平變化，RSV感染組IFN-α／β的表達量較正常對照組逐漸升高，具有時間依賴性。RSV感染組和正常對照組比較，感染的4 h后檢測到IFN-α／β表達水平逐漸升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05），12 h后升高有統(tǒng)計學意義（P＜0．01）。在TLR7 siRNA沉默組，不同感染時間點IFN-β的表達量均低于RSV感染組，24 h后有統(tǒng)計學意義（F＝7．845，P＜0．05）。在各感染時間點TLR7 siRNA沉默組，IFN-α的表達量均低于RSV感染組，12 h后差異有統(tǒng)計學意義（F＝6．181，P＜0．05），且IFN-α下降的更為明顯。見圖8。

3　討論

RSV是引起世界范圍內(nèi)嬰幼兒下呼吸道感染最主要病原體之一，感染后可誘導宿主表達大量的細胞因子等生物活性介質(zhì)，導致嚴重的細支氣管炎、肺炎、哮喘等疾病［6］。Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）是一類進化保守的模式識別受體，能識別和啟動不同病原體的相關模式分子，隨后誘導TLRs依賴的基因表達，通過級聯(lián)反應，進而引起I 型IFN和促炎癥細胞因子的表達，介導先天性免疫和調(diào)節(jié)適應性免疫應答來防御病毒的感染［7］。I型IFN中IFN-α和IFN-β是發(fā)揮早期抗病毒和調(diào)節(jié)免疫活性的主要效應分子，IRF調(diào)控干擾素基因的轉錄表達，其中 IRF7活化IFN-α啟動子，導致Ⅰ型IFN和其他細胞因子的表達和分泌，介導抗病毒免疫應答。但目前對RSV感染誘導干擾素產(chǎn)生及其在RSV致病中的作用仍不明確。已有研究［8-10］表明在RSV感染嬰幼兒的鼻咽洗液中檢測到I型IFN表達，IFN甚至可以引起免疫病理反應。因此，探討TLR7活化在介導的Ⅰ型IFN的產(chǎn)生機制及其在RSV致病中的作用，具有非常重要的意義。

本實驗研究表明，RSV感染A549細胞時可活化上調(diào)TLR7、IRF7、IFN-α／β的mRNA和TLR7的蛋白表達以及和培養(yǎng)上清液中IFN-α／β；在加入TLR7 siRNA后，TLR7、IRF7、IFN-α／β的表達較RSV感染組明顯下調(diào)，說明沉默TLR7后，下調(diào)了IRF7的表達，進而導致IFN的產(chǎn)生減少，起到的抗病毒作用降低。當A549細胞受到RSV感染時，TLR7識別病毒的ssRNA，主要通過級聯(lián)反應將信號傳遞給IRF7，導致I型IFN的表達分泌，介導抗病毒作用。這與Davidson et al［11］在小鼠肺炎病毒感染BALB／c小鼠誘導急性肺炎的研究結果中TLR7的作用相一致。本課題組用TLR7 siRNA特異性沉默了TLR7的表達，研究其在RSV感染A549細胞中誘導I型IFN的抗病毒作用，更進一步說明了TLR7的作用。

通過研究顯示，用TLR7 siRNA抑制了TLR7mRNA表達后，IFN-α／β的表達雖然均有下調(diào)，但IFN-α表達較IFN-β更顯著下調(diào)，表明由TLR7誘導產(chǎn)生的最主要I型IFN可能是IFN-α，且I型IFN的表達至少是部分依賴TLR7活化，TLR7可能為誘導產(chǎn)生IFN抗病毒作用中的一個關鍵因素。進一步研究TLR7在機體抗病毒感染中的作用，可為臨床治療RSV感染及研發(fā)抗RSV新藥提供重要思路。

參考文獻

［1］Wong TM，Boyapalle S，Sampayo V，et al．Respiratory syncytial virus（RSV）infection in eldly mice results in altered antiviral gene expression and enhanced pathology［J］．PLoSOne，2014，9 （2）：e88764．

［2］Nair H，Nokes D J，Gessner B D，et al．Global burden of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children：a systematic review and meta-analysis［J］．Lancet，2010，375（9725）：1545-55．

［3］Hall C B．Respiratory syncytial virus in young children［J］．Lancet，2010，375（9725）：1500-2．

［4］Lund JM，Alexopoulou L，Sato A，et al．Recognition of singlestranded RNA viruses by Toll-like receptor7［J］．Proc Natl Acad Sci U SA，2004，101（15）：5598-603．

［5］Crozat K，Beutler B．TLR7：A new sensor of viral infection［J］．Proc Natl Acad Sci U SA，2004，101（18）：6835-6．

［6］黃升海，劉偉，史曉佾，等．呼吸道合胞病毒感染巨噬細胞誘導炎性基因表達的部分機制研究［J］．中國人獸共患病學報，2009，25（10）：948-52．

［7］Meylan E，Tschopp J．Toll-like receptors and RNA helicases：two parallelways to trigger antiviral responses［J］．Mol Cell，2006，22（5）：561-9．

［8］Scagnolari C，Midulla F，Trombetti S，et al．Upregulation of interferon-induced genes in infants with virus-associated acute bronchiolitis［J］．Exp Biol Med（Maywood），2007，232（10）：1355 -9．

［9］Scagnolari C，Midulla F，Pierangeli A，et al．Gene expression of nucleic acid-sensing pattern recognition receptors in children hospitalized for respiratory syncytial virus-associated acute bronchiolitis［J］．Clin Vaccine Immunol，2009，16（6）：816-23．

［10］Welliver R C Sr．The immune response to respiratory syncytial virus infection：friend or foe？［J］．Clin Rev Allergy Immunol，2008，34（2）：163-73．

［11］Davidson S，Kaiko G，Loh Z，et al．Plasmacytoid dendritic cells promote host defense against acute pneumovirus infection via the TLR7-MyD88-dependent signaling pathway［J］．J Immunol，2011，186（10）：5938-48．

The role of TLR7 in A549 cellsw ith the respiratory syncytial virus infection induced type I interferon

He Hanwen1，Wang Cong2，Du Boyi2，et al
（1Dept of Microbiology，2School of Life Sciences，Anhui Medical University，Hefei230032）

AbstractObjectiveThis experimentwas designed to explore the antiviral effect of TLR7 when A549 cellswere infected by respiratory syncytial virus（RSV）to induce the production of type I interferon（IFN）．MethodsThis experimentwas divided into normal control group，RSV infection group and TLR7 silence group．In each group cell and culture supernatantwere collected after having been infected for 4，8，12 and 24 h．TLR7 siRNA was transfected in A549 cells by transient transfection．With the use of the RT-PCR assay，TLR7 gene silencing effect could be detected；with the use of Trizol reagent，the totalRNA could be extracted and the expression dynamicsofmRNA in TLR7，IRF7，IFN-αand IFN-βcould be detected；with the use of Western blot，protein expression could be tested；with the use of ELISA，the variation of IFNα／βin the culture supernatant of A549 cells infected in the different points of time could be detected．Results①24 h after transfection，TLR7 siRNA-2 could restrain the expression of TLR7 mRNA effectively with statistical significance．②The expression ofmRNA in TLR7，IRF7 and IFN-α／β，togetherwith TLR7 protein，which existed time dependent relation with RSV infection，had increased after A549 cells had been infected by RSV．Meanwhile，compared with RSV infection group，the expression ofmRNA in TLR7，IRF7 and IFN-α／β，togetherwith TLR7 protein had decreased obviously in TLR7 silence group．③Compared with RSV infection group，the expression of IFN-α／βin cell culture supernatant and in TLR7 silent group had decreased，and the expression of IFN-αdecreased obviously．Itwentwithout saying that the difference of decrease in two groups had statistical significance．ConclusionAfter cell A549 have been infected by RSV，TLR7 could be activated and then induce type I interferon after having been infected by RSV，which play the role in anti-virus．Noticeably，IFN-αaccounts for themost of e type I interferon．

Key wordsrespiratory syncytial virus，A549 cells；Toll-like receptors 7；siRNA；Type I interferon

中圖分類號R 373．14

文獻標志碼A

文章編號1000-1492（2015）11-1560-06

基金項目：安徽高校省級自然科學研究重點項目（編號：KJ2012A152）；安徽省自然科學基金（編號：1308085MH129）；安徽省級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（編號：AH201410366135）

作者單位：安徽醫(yī)科大學1基礎醫(yī)學院生物學教研室、2生命科學學院2012級生物技術專業(yè)，合肥230032

作者簡介：何漢文，男，碩士研究生；