張杰，熊文，張映，王嬌，楊洪一*，王濱松

(1.東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150040；2.黑龍江大學(xué)化學(xué)化工與材料學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150080)

納米銀具有催化、抗菌、非線性光學(xué)及導(dǎo)熱、導(dǎo)電等特性，在無(wú)機(jī)催化材料、抗菌劑、導(dǎo)電漿料等領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景[1–4]。目前，納米銀制備多采用物理和化學(xué)方法，尋找簡(jiǎn)單環(huán)保的適合大規(guī)模制備的均一性好、穩(wěn)定性好的納米銀制備方法，仍然是廣大納米材料研究者面臨的富有挑戰(zhàn)性的課題。相對(duì)于化學(xué)方法，生物方法合成具有條件溫和、操作簡(jiǎn)單、環(huán)境友好等特點(diǎn)。藻類[5]、細(xì)菌[6–8]、真菌[9–11]等許多微生物與硝酸銀作用都能制備納米銀粒子。細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖快，生長(zhǎng)周期短，可大規(guī)模制備納米銀，是一種極具潛力的微生物材料。目前，關(guān)于制備納米銀優(yōu)良菌株篩選的報(bào)道較少。筆者擬篩選出納米銀高產(chǎn)率化制備的優(yōu)良菌株，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品來(lái)源

于東北林業(yè)大學(xué)林場(chǎng)取土壤樣品，共設(shè)6個(gè)樣點(diǎn)，于距地面深20 cm處取樣。將樣品混合后組成代表樣，裝入無(wú)菌封口塑料袋內(nèi)，于4℃冰箱保存，備用。

1.2 培養(yǎng)基

Luria–Bertani(LB)培養(yǎng)基的制備：將胰蛋白胨10g、酵母提取物 5g、NaCl 10g 混合，加蒸餾水定容至1 000mL，pH 調(diào)至7.4。

改良Luria–Bertani(LB)培養(yǎng)基(不加NaCl，防止生成氯化銀沉淀)的制備：將胰蛋白胨 10g 和酵母提取物 5g 混合，加蒸餾水定容至1 000mL，調(diào)pH 至7.4。

1.3 主要儀器與試劑

主要儀器：HZQ–F160A 型高低溫恒溫振蕩培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)；GeneAmp9700 型PCR 擴(kuò)增儀(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)中國(guó)公司)；himacCF16RX 型高速冷凍離心機(jī)(日本HITACHI 公司)；TECNAI G2 型透射電子顯微鏡(荷蘭Philips– FEI 公司)；Bruker D8 型X–射線衍射儀(德國(guó)Bruker 公司)；熱重分析儀(TGA/ DSC2)。

主要試劑：DNA 提取試劑盒和凝膠回收試劑盒(北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司)；E.coli JM109 感受態(tài)細(xì)胞(BioDev 公司)；pMD18–T Vector、PCR 反應(yīng)用的試劑(大連TaKaRa 公司)；Tryptone、Yeast Extract 和NaCl(Oxied 公司)；細(xì)菌微量生化反應(yīng)管(杭州天和微生物試劑有限公司)；氨芐青霉素(哈爾濱制藥總廠)；其他常規(guī)試劑均為分析純。

1.4 菌種的篩選

稱取土壤樣品5g，加入到裝有5mL 蒸餾水的三角瓶中，制成土壤懸浮液。取1mL 懸浮液接種于改良的LB 液體培養(yǎng)基中，150 r/min 振蕩，富集培養(yǎng)18 h 后，向富集培養(yǎng)液中加入硝酸銀溶液，使硝酸銀終濃度為0.1 mmol/L，避光馴化48 h，分別逐級(jí)提高硝酸銀的濃度至0.2、0.3、0.5、0.7、1.0 mmol/L。進(jìn)行多次富集與馴化后，取1.0 mmol/L的菌液，在LB 固體培養(yǎng)基上進(jìn)行濃度梯度稀釋劃線分離，得到能在含1 mmol/L 硝酸銀的改良LB 培養(yǎng)基上存活的菌株，于4℃冰箱中保存，備用。

1.5 菌株的鑒定

1.5.1 常規(guī)鑒定

用透射電子顯微鏡觀察所獲得菌株的形態(tài)和大小，進(jìn)行革蘭氏染色、芽孢染色和鞭毛染色[12]。采用細(xì)菌微量生化反應(yīng)管對(duì)細(xì)菌的伏普(V–P)反應(yīng)、硝酸鹽培養(yǎng)基生長(zhǎng)、糖發(fā)酵產(chǎn)酸、淀粉水解、明膠液化、檸檬酸鹽利用、硝酸鹽還原和酪素分解[13–18]等生理生化試驗(yàn)進(jìn)行鑒定。

1.5.2 16SrDNA 序列分析

菌株基因組采用細(xì)菌DNA 提取試劑盒提取，以細(xì)菌總DNA 為模板，利用細(xì)菌通用引物(27 F(5'–AGAGTTTGATCCTGGCTCAG–3')和1492 R (5'–GGTTACCTGTTACGT–3')進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。

PCR 反應(yīng)體系：將10×PCR Buffer 5 μL、10 mmol/L 的dNTPs 1 μL、2.5 μmol/L 的上游和下游引物各4 μL、5 U/μLTaq 酶0.5 μL，DNA1 μL 模板混合，加去離子水至總體積50 μL。

PCR 反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸2min，30個(gè)循環(huán)；72℃保溫10min。4℃保存。

用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小和特異性。PCR 產(chǎn)物純化后，用膠回收試劑盒回收目的片段，并與PMD18–T 連接，轉(zhuǎn)化E.coli JM109，然后在含有氨芐霉素(AMP)的培養(yǎng)基中挑取白色單菌落(陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。將陽(yáng)性克隆子送至上海生物工程公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序所獲序列信息提交GenBank 核酸數(shù)據(jù)庫(kù)，用BLAST 程序進(jìn)行比對(duì)，搜索同源性較高的相關(guān)序列，采用MEGA5.2軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。進(jìn)化樹(shù)分支穩(wěn)定性用 Bootstrap 分析，重復(fù)1 000次。

1.6 納米銀的合成及表征方法

刮取固體平板菌種一環(huán)，接入LB 液體培養(yǎng)基中，于37℃恒溫?fù)u床上150 r/min 培養(yǎng)18 h，進(jìn)行菌種活化。取5mL 活化好的菌株接入300mL 改良的LB 液體培養(yǎng)基中，于37℃恒溫?fù)u床150 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h。取198mL 細(xì)菌培養(yǎng)液，加入2mL 0.1 mol/L 的AgNO3溶液，使其Ag+終濃度為1 mmol/L，避光培養(yǎng)3 d。將培養(yǎng)液于14 000 r/min 離心10min，用蒸餾水洗沉淀3次，自然風(fēng)干，得到納米銀顆粒。納米銀顆粒用X–射線衍射儀(XRD)進(jìn)行表征，工作電壓40 kV，掃描速度為10o/min；利用透射電子顯微鏡(TEM)在80 kV 電壓下觀察納米銀的形貌及納米銀的大??；采用熱重分析儀(TGA)對(duì)離心得到的納米銀顆粒沉淀物進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選結(jié)果

通過(guò)逐級(jí)提高硝酸銀的濃度，富集和馴化，篩選出了1 株能在含1 mmol/L 硝酸銀改良液體LB 培養(yǎng)基中存活的菌株，將其命名為zxw01。加入AgNO3避光培養(yǎng)后，圖1–c 中菌株的顏色由土黃色變?yōu)榧t棕色，而圖1–a 和圖1–b 中菌株的顏色無(wú)變化。這種明顯的顏色變化與金屬粒子的表面等離子體共振效應(yīng)(SPR 效應(yīng))有關(guān)，據(jù)此，可初步判定菌株zxw01 有合成納米銀的能力。

圖1 添加硝酸銀前后菌株zxw01 的顏色變化 Fig.1 Color change of the zxw01 bacteria before and after AgNO3 added

2.2 菌株鑒定結(jié)果

2.2.1 菌落的形態(tài)及其生理、生化特征

由圖2 可以看出，菌體呈桿狀，大小為(1.23～1.78) μm ×(0.36～0.85) μm。

圖2 菌株zxw01 的電鏡照片 Fig.2 TEM image of zxw01

菌株zxw01 在LB 固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落為圓形，表面光滑，邊緣整齊，呈黃色，細(xì)菌革蘭氏染色為陽(yáng)性，芽孢染色可見(jiàn)卵圓形芽孢，孢囊膨大，中生或近中生，鞭毛染色可觀察到菌株的鞭毛，光學(xué)顯微鏡暗視野中可觀察到該細(xì)菌能運(yùn)動(dòng)。

從表1 可知，該菌株不能利用D–木糖、乳糖、L–阿拉伯糖、蜜二糖、山醇、甘糖、肌醇、甘露醇、鼠李糖、山梨醇和乳糖，可以利用檸檬酸、葡萄糖、果糖、尿素、馬尿酸、麥芽糖和蔗糖，明膠液化、淀粉水解、過(guò)氧化氫酶、伏普(V–P )和硝酸鹽還原試驗(yàn)結(jié)果均呈陽(yáng)性，苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)結(jié)果呈陰性。參照《伯杰細(xì)菌手冊(cè)》和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》，可初步鑒定該菌為解淀粉酶芽孢桿菌。

表1 菌株zxw01 的生理生化試驗(yàn)結(jié)果 Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain zxw01

2.2.2 zxw01 的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

以菌株基因組DNA 為模板，以細(xì)菌16 SrDNA的通用引物進(jìn)行RCR 擴(kuò)增，對(duì)菌株的16 SrDNA 進(jìn)行測(cè)序，得到1 514 bp 序列。將測(cè)序結(jié)果提交到GenBank，登錄號(hào)為KF 700242。用BLAST 程序?qū)@得的16 SrDNA 序列與GenBank 中的所有序列進(jìn)行核苷酸同源性對(duì)比，采用MEGA5.2 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，用自展法(Bootstrap)檢驗(yàn)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的可靠性，自展1 000次得到菌株zxw01 的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖3)。由圖3 可見(jiàn)，菌株zxw01 與解淀粉酶芽孢桿菌屬形成一個(gè)族群，且同源性達(dá)99%以上。結(jié)合形態(tài)學(xué)、生理生化特征以及16 SrDNA 分析，最終將zxw01 鑒定為芽孢桿菌屬的解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens )。

圖3 基于16SrDNA 序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù) Fig.3 Phylogenetic tree of the bacteria strain based on 16 SrDNA sequenceshomology

2.3 納米銀的XRD 分析結(jié)果

由圖4 可以看出，在2θ 斜角為38.23°、44.56°、64.87°和77.48°處出現(xiàn)了明顯的特征性衍射峰，與JCPDS 卡 04–0783 上的數(shù)據(jù)(2θ 為 38.096°、44.257°、64.406°和77.452°)吻合，分別對(duì)應(yīng)于立方晶系銀的(111)、(200)、(220)和(311)，說(shuō)明該細(xì)菌在添加硝酸銀后合成了面心立方結(jié)構(gòu)的納米銀顆粒，并且納米銀是無(wú)雜質(zhì)的。

圖4 利用zxw01 培養(yǎng)液合成的納米銀XRD 衍射圖譜 Fig.4 XRD pattern of AgNPs synthesized by the bacteria strain of zxw01

2.4 納米銀的TEM 分析結(jié)果

由圖5 可清楚地觀察到銀納米粒子的形態(tài)和粒徑大小，大部分為球形或近球形，粒徑大小為2～18 nm，平均粒徑為12.6 nm，粒徑分布窄且較均勻，具有較好的分散性，幾乎沒(méi)有團(tuán)聚現(xiàn)象。

圖5 zxw01 培養(yǎng)液合成納米銀的TEM 圖譜 Fig.5 TEM image of AgNPs synthesized by the bacteria strain of zxw01

2.5 納米銀顆粒的熱重分析結(jié)果

Ag+終濃度為1 mmol/L 的培養(yǎng)液200mL 制備納米銀，最終離心后可獲得0.03g 的納米銀顆粒沉淀物。對(duì)沉淀物進(jìn)行熱重分析的結(jié)果(圖6)表明，隨著加熱溫度的升高，納米銀顆粒的質(zhì)量逐漸減少，當(dāng)溫度上升到580℃時(shí)達(dá)到熱穩(wěn)定狀態(tài)，不再有質(zhì)量損失。其原因在于離心后得到的納米銀顆粒沉淀中含有的水和有機(jī)物，這些水和有機(jī)物在加熱過(guò)程中不斷釋放，最后達(dá)到穩(wěn)定。熱穩(wěn)定狀態(tài)時(shí)得到的納米銀質(zhì)量為納米銀顆粒沉淀物質(zhì)量的58%，由此可知，納米銀的實(shí)際產(chǎn)量為0.017 4g(0.03×58%)，又知納米銀的理論產(chǎn)量為0.021 6g(0.2 (L)×1×10－3(mol/L)×108(g/mol))，因此，納米銀產(chǎn)率為80.6%(實(shí)際產(chǎn)量/理論產(chǎn)量)。

圖6 納米銀的熱重分析 Fig.6 Thermogravimetric analysis of silver nanoparticles

3 結(jié)論與討論

逐漸加大硝酸銀濃度進(jìn)行富集與馴化，篩選得到1 株能還原制備納米銀的菌株zxw01。該菌株能在含1 mmol/L 硝酸銀的改良LB 液體培養(yǎng)基中存活，并且能使得添加硝酸銀的菌株培養(yǎng)液由土黃色變?yōu)樽丶t色，合成的納米銀是分散的，呈球形或近球形，粒徑為2～18 nm，納米銀產(chǎn)率為80.6%。經(jīng)個(gè)體形態(tài)特征鑒定、生理生化特征鑒定和16 SrDNA 序列分析，將該菌鑒定為解淀粉酶芽孢桿菌(Bacillus amyqueciens)。

目前，在同類研究中，用細(xì)菌制備納米銀比用真菌更具優(yōu)勢(shì)。細(xì)菌繁殖快，生長(zhǎng)周期短，且關(guān)于細(xì)菌的發(fā)酵和遺傳改造經(jīng)驗(yàn)比關(guān)于真菌的更為豐富，這有利于基因工程操作，可以利用基因工程技術(shù)，使特定的具有還原作用的酶以及起穩(wěn)定作用的蛋白大量表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)納米粒子的大規(guī)模制備，所以，細(xì)菌在納米銀合成領(lǐng)域具有發(fā)展?jié)摿?，有待進(jìn)一步研究。

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