王 敏， 王 娟， 徐 鼎， 呂立夏，3， 王 方， 徐國彤，3

(1. 同濟大學(xué)醫(yī)學(xué)院眼科研究所臨床視覺科學(xué)實驗室，上海 200092； 2. 同濟大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院眼科，上海 200072；3. 同濟大學(xué)醫(yī)學(xué)院再生醫(yī)學(xué)系生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，上海 200092)

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·基礎(chǔ)研究·

目標區(qū)域測序診斷CRB1突變導(dǎo)致的視網(wǎng)膜變性

王 敏1， 王 娟1， 徐 鼎2， 呂立夏1，3， 王 方2， 徐國彤1，3

(1. 同濟大學(xué)醫(yī)學(xué)院眼科研究所臨床視覺科學(xué)實驗室，上海 200092； 2. 同濟大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院眼科，上海 200072；3. 同濟大學(xué)醫(yī)學(xué)院再生醫(yī)學(xué)系生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，上海 200092)

目的 研究一例疑是視網(wǎng)膜變性的患兒，進行基因檢測并作出明確的基因診斷。方法 常規(guī)檢查患兒和家屬的眼睛，特別是視網(wǎng)膜的情況。收集患者及家庭成員的外周靜脈血液，提取基因組DNA。通過目標區(qū)域外顯子組序列捕獲聯(lián)合新一代測序(簡稱目標區(qū)域測序)，利用生物信息學(xué)分析篩選出一系列可能的突變，再通過Sanger測序和共分離研究進行驗證，從而確定先證者的致病突變。最后，通過PCR和Sanger測序檢測突變基因。結(jié)果 患兒視力障礙嚴重，眼底檢查所見符合視網(wǎng)膜變性。其他人眼睛正常。基因診斷結(jié)果表明，先證者攜帶CRB1基因的復(fù)合雜合性致病突變(c.3521G>C和c.1141_1142 insTGGCT)。這兩個突變分別來源于父親(c.3521G>C， p.C1174S)和母親(c.1141_1142insTGGCT)，為隱性遺傳?；純旱牡艿?新生兒)只有一個c.1141_1142 insTGGCT突變，表明他不會發(fā)病。建議新生兒長大后在生育前要進行遺傳檢查和咨詢。結(jié)論 目標區(qū)域測序的基因診斷方法是檢測視網(wǎng)膜變性疾病突變基因的強大工具，有利于對患者做出早期、明確、分子水平的診斷，在特定疾病的理解、預(yù)防和預(yù)后判定方面能發(fā)揮重要作用。同時為其尚無法做臨床檢查和診斷的新生兒弟弟進行了基因診斷，通過預(yù)測，排除了發(fā)病的可能。

基因診斷； 目標區(qū)域測序； CRB1基因； 視網(wǎng)膜變性

視網(wǎng)膜變性是一類常見的、遺傳性致盲眼病。與這類疾病發(fā)病相關(guān)的基因缺陷很多，crumbs同系物1基因(crumbs homolog 1， CRB1; Gene ID： 23418， OMIM 604210)是果蠅基因的人類同源物，僅在人類視網(wǎng)膜和大腦中表達。有研究預(yù)測，其編碼的蛋白質(zhì)CRB1為一種跨膜蛋白，以跨膜域和胞外域為主，包括表皮生長因子(epidermal growth factor， EGF)樣結(jié)構(gòu)域，鈣結(jié)合表皮生長因子(calcium-binding epidermal growth factor， cbEGF)樣結(jié)構(gòu)域以及層粘連蛋白laminin AG樣結(jié)構(gòu)域，能與其他細胞外或跨膜蛋白相互作用。研究表明，小鼠中CRB1的突變可影響視網(wǎng)膜的結(jié)構(gòu)及光感受器細胞的生長[1-2]，提示其在視網(wǎng)膜中具有非常重要的作用。

據(jù)報道，多個嚴重且較常見的視網(wǎng)膜變性疾病都可能與CRB1基因突變有關(guān)[3-4]，如視網(wǎng)膜色素變性12(retinitis pigmentosa 12， RP12， OMIM 600105)，Leber先天性黑朦8(leber congenital amaurosis 8， LCA8)，視桿-視錐和視錐-視桿營養(yǎng)不良，視網(wǎng)膜色素變性伴有coats-like滲出性血管病變，視網(wǎng)膜異常分層等。CRB1突變導(dǎo)致其編碼的光感受器細胞內(nèi)節(jié)的蛋白質(zhì)異?？赡苁沁@些疾病的共同的病理學(xué)基礎(chǔ)。目前，視網(wǎng)膜變性疾病的發(fā)病機制并不明確，并沒有良好的治療手段。有研究曾用大鼠誘導(dǎo)性多能干細胞誘導(dǎo)分化神經(jīng)前體細胞，有可能作為細胞移植治療視網(wǎng)膜退行性疾病的供體細胞[5]。而深入認識CRB1基因，有可能對多個視網(wǎng)膜變性的預(yù)防和治療有所幫助，為基因治療打下良好基礎(chǔ)。

本研究采用目標區(qū)域外顯子組序列捕獲聯(lián)合新一代測序(簡稱目標區(qū)域測序，target exome capture and next generation sequencing)的方法，診斷出疑為視網(wǎng)膜變性的患兒攜帶有CRB1復(fù)合雜合性致病突變(c.3521G>C和c.1141_1142 insTGGCT)，并對其剛出生的弟弟進行了預(yù)測，從而排除了其弟弟發(fā)生嚴重視網(wǎng)膜變性的可能，提示此方法在特定疾病診斷和預(yù)后判定等方面可以發(fā)揮重要作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

患兒為同濟大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院眼科遺傳門診就醫(yī)的患者為男性，3歲。此外，家長也帶患兒弟弟(新生嬰兒)來本門診進行遺傳咨詢，并要求對嬰兒進行基因診斷。受試對象來自中國浙江省，漢族人。本研究遵循赫爾辛基宣言，參與者或監(jiān)護人均需充分了解并簽署知情同意書。研究過程嚴格遵守臨床研究的制度。眼科醫(yī)生對受試者進行眼科檢查。受試者外周靜脈采集2ml血液。使用RelaxGene血液基因組提取試劑盒(DP319)[天根生化科技(北京)有限公司]試劑，嚴格按照說明書提取DNA。

1.2 方法

1.2.1 運用目標區(qū)域測序進行分子遺傳分析 采用文獻中的定制目標區(qū)域試劑盒[6]，即定制設(shè)計AgilentTMSureSelect外顯子序列。將基因組DNA與定制目標區(qū)域試劑盒結(jié)合，運用IlluminaTMMiseq平臺對結(jié)合的外顯子片段進行高通量測序。最后運用生物信息學(xué)軟件找出突變體及相關(guān)注釋。

1.2.2 新一代測序數(shù)據(jù)注釋和分析 通過使用自行設(shè)定的篩選程序，首先預(yù)測假定的致病突變體，包括dbSNP和NCBI數(shù)據(jù)庫(http：∥ncbi.nlm.nih.gov)未包含的可導(dǎo)致閱讀框改變的無義、錯義、短小的插入或缺失片段，以及所有位于外顯子-內(nèi)含子交界區(qū)的突變體。

1.2.3 基因突變致病性的評估 用Sanger測序法對預(yù)測的致病突變進行驗證，并對患者及其父母進行共分離分析。用PCR擴增包含突變位點的基因組片段。利用GenBank數(shù)據(jù)庫找出CRB1基因DNA、mRNA和蛋白質(zhì)序列(NC_000001.10，NM_201253.2，NP_957705.1)。運用PrimerSelect軟件(Lasergene 8.0; DNASTAR， Inc.)設(shè)計引物，對突變片段進行擴增，PCR產(chǎn)物送上海博尚生物技術(shù)有限公司進行測序。引物序列見表1。PCR擴增子序列經(jīng)Sanger測序法驗證后，運用Seqman軟件(Lasergene 8.0; DNASTAR， Inc.)比較測序序列與參考序列以確定突變。每個致病突變在300個正常人標本中進行驗證。

表1 PCR和Sanger測序驗證用到的引物序列

2 結(jié) 果

2.1 目標區(qū)域測序

使用目標區(qū)域測序，同時測定了226個遺傳性視網(wǎng)膜變性相關(guān)基因的序列。生物信息學(xué)分析獲得帶注釋的測序數(shù)據(jù)?；颊叩腄NA片段中含有3732個SNP和305個小的插入和缺失(indels)。也應(yīng)用互補數(shù)據(jù)分析對相關(guān)度高的遺傳變異進行選擇。通過使用自定義過濾系統(tǒng)，使候選突變體的數(shù)量減少到69個SNP和小的插入和缺失(indels)。最后對這些篩選的致病突變做進一步分析。

2.2 特定突變的致病性分析及驗證

對篩選的致病突變進行分析后，發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜變性患兒(先證者)同時攜帶CRB1基因的兩個突變(圖1)： 一個雜合的錯義突變(c.3521G>C，p.C1174S)和一個雜合的插入突變(c.1141_1142insTGGCT，p.F381Lfs*11)。這兩個雜合性突變均為致病性突變。c.3521G>C(p.C1174S)突變可以導(dǎo)致位于EGF15功能域的非極性半胱氨酸被極性絲氨酸替代。相關(guān)脊椎動物同源比對分析(Magalign軟件分析)顯示，半胱氨酸在CRB1蛋白質(zhì)1174位高度保守(圖2)。

圖1 家系圖(左上)和Sanger測序結(jié)果Fig.1 Family map(left) and Sanger sequencing results家系圖中Ⅱ-1是患病個體。家系中每個個體的CRB1基因測序結(jié)果(突變的和正常的序列)圖中，箭頭所示為突變位點。左列： CRB1 c.3521G>C 突變，右列： CRB1 c.1141_1142insTGGCT突變

圖2 Magalign軟件對同源基因的保守性分析Fig.2 Conserved analysis of homology gene by Magalign softwarec.3521G>C(p.C1174S)位在不同物種來源的CRB1基因高度保守。人(Homo sapiens， NP_001180569)，小鼠(Mus musculus， NP_573502)，斑馬魚(Danio rerio， NP_001038408)，大鼠(Rattus norvegicus， NP_001100652)，牛(Bos taurus， NP_001179411)，猴子(Macaca mulatta， XP_0011109120)，狗(Canis lupus familiaris， XP_005622350)，猩猩(Pan troglodytes， XP_003308729)

c.1141_1142insTGGCT(p.F381Lfs*11)突變定位在cbEGF9結(jié)構(gòu)域，這種突變導(dǎo)致閱讀框發(fā)生改變，從而截斷蛋白質(zhì)，只留下390個氨基酸殘基，而完整的CRB1共含有1294個氨基酸殘基。

對家庭成員進行共分離研究的結(jié)果表明，患者的父親只攜帶突變(c.3521G>C)，而母親也只攜帶另一個突變(c.1141_1142insTGGCT)，兩人表型均正常。檢查了新生兒的這兩個突變情況，結(jié)果表明患兒只有一個突變(c.1141_1142insTGGCT)。新生兒和母親所攜帶的CRB1突變信息情況一樣，是致病基因的攜帶者，但不會患病。家系中各成員攜帶的CRB1突變分析見表2。

300個正常對照個體中未同時出現(xiàn)CRB1基因的兩種突變。

表2 家系中各成員攜帶的CRB1突變分析

注： 利用生物信息學(xué)工具PolyPhen(Polymorphism Phenotyping)和SIFT(sortingintolerant from tolerant)，通過分析目的蛋白序列的保守性以及突變氨基酸的生化特性來預(yù)測氨基酸的替換對蛋白質(zhì)功能造成的影響

2.3 臨床檢查結(jié)果

患兒男性，3歲，出生后2個月由父母發(fā)現(xiàn)眼睛異常。3歲時第一次就診?；颊邽樵绠a(chǎn)兒，出生時僅34周+2，體質(zhì)量2000g。其癥狀為： 目不能追逐物體，視力低下，眼球震顫。就診時能配合醫(yī)生檢查。檢查發(fā)現(xiàn)患者具有LCA的典型表現(xiàn)[7]： 眼手征兆(Oculodigital，眼球內(nèi)陷)，無畏光，雙眼視力僅為眼前指數(shù)。眼底檢查可見： 視盤小、色紅，血管細，彌漫性地毯樣視網(wǎng)膜變性，黃斑區(qū)金箔樣反光，黃斑變性區(qū)及其周圍區(qū)可見白點(圖3)，后極部有圓形或不規(guī)則色素沉積[8-9]，視網(wǎng)膜異常分層，與文獻報道一致。ERG反應(yīng)消失，無記錄波形(數(shù)據(jù)未顯示)。光學(xué)相干斷層掃描(OCT)檢查顯示，視網(wǎng)膜變薄和光感受器細胞層缺失(數(shù)據(jù)未顯示)。

患兒視力很差，接近完全失明。結(jié)合CRB1復(fù)合雜合性突變的確認，診斷為Leber先天性黑朦(LCA; OMIM 20400)，這是一種發(fā)病最早、癥狀最嚴重的遺傳性視網(wǎng)膜變性疾病。

其父母否認近親結(jié)婚。父母雙方各攜帶一個CRB1雜合性突變。兩人均近視，但矯正視力正常，眼底檢查和視野也均表現(xiàn)正常?；純汉透改傅呐R床信息見表3。

圖3 患兒(Ⅱ∶1)及其父母(Ⅰ∶1，Ⅰ∶2)的眼底檢查結(jié)果Fig.3 The clinical results of the proband(Ⅱ∶1) and their parents(Ⅰ∶1，Ⅰ∶2)

項目性別年齡/歲檢查時發(fā)病時間癥狀視力右眼左眼眼底電生理Ⅱ∶1先證者患兒男3出生后幾個月不追物,視力差,眼球震顫,特征性眼動指動指動血管變細,地毯樣視網(wǎng)膜變性,黃斑變性記錄不到波形Ⅰ∶1父親正常男29無記錄無0.60.6正常正常Ⅰ∶2母親正常女32無記錄無0.80.8正常正常Ⅱ∶2弟弟正常男新生兒無記錄無追物,追光追物,追光無記錄無記錄

3 討 論

CRB1突變在視網(wǎng)膜變性中較多見。有英國[4]和西班牙[10]曾報道，CRB1突變占視網(wǎng)膜變性患者約11%。CRB1突變在瑞典[11]、日本[12]也都有引起LCA的報道。相比之下，國內(nèi)關(guān)于LCA群體中CRB1突變的報道很少[8-9，13]。有一項研究顯示，在87個漢族LCA患者中，CRB1突變占11.5%，頻率僅次于GUCY2D(16.1%)，是LCA的第二常見病因[8]。研究表明，CRB1突變在視網(wǎng)膜變性發(fā)病及研究中占有重要地位。明確診斷后，可以直接解決10%以上患者的疾病預(yù)測，加深對CRB1突變致病機制的認識。

CRB1是目前一個已知的、確定的眼底變性致病基因。本研究通過大規(guī)模基因測序發(fā)現(xiàn)大量的SNP，并從疑為視網(wǎng)膜變性的患者中發(fā)現(xiàn)了CRB1基因的兩個突變位點： c.3521G>C和c.1141_1142 insTGGCT；沒有發(fā)現(xiàn)其他可能的致病變異。父親攜帶的c.3521G>C變異和母親攜帶的c.1141_1142insTGGCT變異在該家系中傳遞符合常隱特征，而這兩種突變在300個正常對照個體中未同時出現(xiàn)。因此，推斷CRB1基因被確認為該患兒致病基因。

本研究中，患兒攜帶的這種復(fù)合的CRB1雜合性突變促成了疾病的發(fā)生。其中的c.1141_1142 insTGGCT(p.F381Lfs*11)突變，可導(dǎo)致蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)錄和翻譯時被截短，只剩下360個氨基酸。而另一個突變c.3521G>C(p.C1174S)位于EGF結(jié)構(gòu)域，該位點氨基酸在進化上保守，該位點發(fā)生突變對蛋白功能影響重大。結(jié)合臨床表現(xiàn)，本研究提供的基因診斷，為這個臨床診斷不明確的嚴重視網(wǎng)膜變性的先證者最終診斷為Leber先天性黑朦提供了有力的證據(jù)?；純旱牡艿?新生兒)被檢查出僅遺傳了他母親的一個CRB1基因的突變(c.1141_1142 insTGGCT)，預(yù)測這個新生兒將僅為攜帶者，眼睛正常表型。這一診斷和預(yù)測，消除了孩子家長的思想負擔，使這個家庭能正常生活。提醒適齡婚姻生育青年人需要及時進行遺傳咨詢，以保證后代健康。

目前，視網(wǎng)膜變性疾病的診斷仍是基于臨床檢查和病理學(xué)的診斷。在分子水平，遺傳性視網(wǎng)膜變性所涉及的突變基因數(shù)以百計，致病機制也多有不同。這使得被診斷為視網(wǎng)膜變性的患者的表型異質(zhì)性非常明顯，從表現(xiàn)輕微，進展緩慢到早期發(fā)病并致盲，加之發(fā)病機制不清楚，使得針對視網(wǎng)膜變性的治療效果難以令人滿意，基因治療也無從談起。隨著分子生物學(xué)分子遺傳學(xué)技術(shù)的進展，現(xiàn)在有條件對這類患者及家屬進行明確的基因診斷，使視網(wǎng)膜變性疾病的亞型得以明確，有助于幫助患者判斷預(yù)后、預(yù)測其眼病的發(fā)病情況和特征，以便及早干預(yù)，同時也為理解各亞型視網(wǎng)膜變性的發(fā)病機制和后續(xù)的基因治療奠定基礎(chǔ)。

本研究表明，目標區(qū)域測序是一個可靠、敏感、低成本及高效率的基因診斷方法，能提供明確的遺傳分析?；蛟\斷能以強有力的證據(jù)對遺傳異質(zhì)性特別高的視網(wǎng)膜變性疾病作出精準的臨床診斷。在這個研究中，不僅對先證者作出了明確的基因診斷，還成功地檢測出新生兒的遺傳情況，排除了其發(fā)生嚴重視網(wǎng)膜變性的可能，使產(chǎn)前診斷和優(yōu)生在這個家庭成為可能，可以并推廣到其他患者和家庭。借助這一基因診斷技術(shù)，可以為有需要的生育年齡的群體和嬰幼兒提供一個高效、精準的醫(yī)學(xué)服務(wù)，促使優(yōu)生優(yōu)育。

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Genetic diagnosis of CRB1 mutations in retinal degenerative diseases by target exon sequencing

WANGMin1，WANGJuan1，XUDing2，LVLi-xia1，3，WANGFang2，XUGuo-tong1，2，3

(1. Laboratory of Clinical Vision Science， Tongji Eye Institute， Tongji University， Shanghai 200092， China;2. Dept. of Ophthalmology， Tenth People’s Hospital， Tongji University， Shanghai 200072， China;3. Teaching and Research Section of Biochemistry andMolecular Biology， Regenerative Medicine， Medical College， Tongji University， Shanghai 200092， China)

Objective To investigate genetic diagnosis of CRB1 mutations in retinal degeneration by target exon sequencing. Methods A 3-year child with suspected Leber’s congenital amaurosis(LCA) and 3 family members were included in the study. Peripheral vein blood was collected and genome DNA was extracted; the target exon capture and next generation sequencing(Candidate Exon Sequencing) was performed. Sanger sequencing validation and family cosegregation study were used to identify the causative mutation based on bioinformatic analysis. Results Compound heterozygote mutations of CRB1 gene， c.3521G>C and c.1141_1142 insTGGCT， were identified in the proband. The gene mutations(c.3521G>C， p.C1174S) and(c.1141_1142insTGGCT) were detected from the father and mother of the proband， respectively; while only one mutation(c.1141_1142 insTGGCT) was detected in proband’s younger brother. Conclusion Target exon sequencing can be used to screen known causative gene for retinal degenerative diseases.

genetic diagnosis; target exome capture; CRB1; retinal degeneration

10.16118/j.1008-0392.2015.06.003

2015-06-05

國家自然科學(xué)基金(81100674);上海市衛(wèi)生局項目(2010Y145，20134222);中山眼科中心眼科學(xué)國家重點實驗室開放課題(2013KF05)

王 敏(1986—)，女，碩士.E-mail： wm0323@126.com

徐國彤.E-mail： gtxu@#edu.cn

R 15211

A

1008-0392(2015)06-0013-06