謝彤 巨韓芳 王春花 王志銳 穆成 趙慧 王艷楠 孫蕊 王擷秀

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·論著·

結(jié)核分枝桿菌北京基因型亞型的流行及與耐藥性的關(guān)系研究

謝彤 巨韓芳 王春花 王志銳 穆成 趙慧 王艷楠 孫蕊 王擷秀

目的 通過(guò)分析Mtb北京基因型基因組NTF(noise transfer function)區(qū)插入序列IS6110，揭示北京基因型在進(jìn)化過(guò)程中所形成的古代株和現(xiàn)代株2個(gè)亞型在天津市的流行情況及其與耐藥表型的關(guān)系。方法 收集2012—2014年天津市臨床分離的816株Mtb菌株。采用PCR試驗(yàn)分析菌株基因組中差異區(qū)域(Region of difference, RD)RD207和RD105片段是否有缺失，以鑒定是否為北京基因型。通過(guò)檢測(cè)北京基因型菌株基因組NTF區(qū)中IS6110插入序列的數(shù)目，了解北京基因型菌株中古代株和現(xiàn)代株所占的比例，并進(jìn)一步分析這兩種亞型與菌株耐藥表型間的關(guān)系。計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 在所分析的816株臨床分離的Mtb菌株中，764 (93.63%)株為北京基因型菌株。764株北京基因型菌株中， 110株(14.40%)為古代株， 654株(85.60%)為現(xiàn)代株。現(xiàn)代株中僅有1株為北京基因型W株。在古代株和現(xiàn)代株中，耐異煙肼菌株分別占26.36%(29/110) 和 10.70%(70/654)(χ2=20.47，P<0.01)；耐利福平菌株分別占14.55%(16/110) 和 6.57%(43/654)(χ2=8.40,P<0.01)；耐乙胺丁醇菌株分別占8.18%(9/110) 和3.21%(21/654)，(χ2=6.17，P<0.05)。此外，MDR-TB患者中古代株和現(xiàn)代株分別占13.64%(15/110)和4.74%(31/654)(χ2=13.17，P<0.01)。結(jié)論 Mtb北京基因型中的現(xiàn)代株是天津市的主要流行株，但古代株與耐藥結(jié)核病的關(guān)系更為密切，提示在天津市，對(duì)抗結(jié)核藥物產(chǎn)生耐藥并不是導(dǎo)致北京基因型廣泛流行的主要因素。

結(jié)核分枝桿菌； 基因型； 抗藥性,細(xì)菌； 表型

目前，結(jié)核病仍是全球?qū)е滤劳鋈藬?shù)最多的傳染病。我國(guó)2013年登記的新發(fā)肺結(jié)核患者近90萬(wàn)例，其中大約5.4萬(wàn)例為MDR-TB患者，MDR-TB患者例數(shù)分別占初治和復(fù)治患者的5.7%和26%，我國(guó)仍是僅次于印度的結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家[1]。分子流行病學(xué)研究證實(shí)，受環(huán)境和宿主雙重因素的影響，全球不同區(qū)域流行的主要結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，Mtb)菌株的基因型并不相同。在所發(fā)現(xiàn)的各種基因型中，北京基因型在全球傳播的速度最快，分布也最為廣泛。在我國(guó)不同地區(qū)北京基因型菌株占臨床分離菌株的50%至90%[2]。

北京基因型Mtb菌株最顯著的特點(diǎn)為基因組中差異區(qū)域(Region of difference, RD)RD207片段的缺失，這一缺失使得該基因型在采用間隔區(qū)寡聚核苷酸分型技術(shù) (Spoligotyping)進(jìn)行分型時(shí)1～34的間隔序列缺失[3]。RD105片段缺失是北京基因型的另一個(gè)顯著特點(diǎn)，Chen等[4]利用此特點(diǎn)建立了快速鑒定北京基因型的PCR方法。北京基因型菌株在進(jìn)化過(guò)程中還會(huì)出現(xiàn)RD181、RD142和RD150等片段的缺失[5]。IS6110插入序列的轉(zhuǎn)位(transposition)是北京基因型菌株的另一種進(jìn)化機(jī)制，根據(jù)基因組NTF區(qū)中IS6110的數(shù)目，北京家族又被分為3個(gè)分支[6]。菌株NTF區(qū)中沒(méi)有IS6110，則為古代株，古代株被認(rèn)為是北京基因型進(jìn)化早期的菌株類(lèi)型；菌株NTF區(qū)若有1個(gè)IS6110，則為現(xiàn)代株；若NTF區(qū)包含有2個(gè)IS6110則被稱(chēng)為W型菌株，W型菌株被認(rèn)為是現(xiàn)代北京基因型進(jìn)化過(guò)程中出現(xiàn)的一個(gè)分支，曾在20世紀(jì)90年代中期在美國(guó)紐約等地區(qū)引發(fā)小規(guī)模的MDR-TB流行[7]。本研究旨在初步揭示北京基因型古代株和現(xiàn)代株Mtb在人群中的流行情況，以及這2個(gè)亞型與耐藥表型的關(guān)系。

材料和方法

一、菌株來(lái)源與試劑

1. 菌株：本研究選取天津市結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室收集的2012年1月至2014年2月從天津市結(jié)核病患者痰標(biāo)本中分離培養(yǎng)的Mtb 816株。其中536株分離自市區(qū)結(jié)核病患者；280株分離自其他各區(qū)(縣)結(jié)核病患者，包括濱海新區(qū)42株，東麗區(qū)2株，西青區(qū)28株，津南區(qū)31株，北辰區(qū)54株，武清區(qū)27株，寶坻區(qū)49株，寧河縣25株，薊縣22株。所有菌株經(jīng)對(duì)硝基苯甲酸試驗(yàn)和噻吩-2-羧酸肼生長(zhǎng)試驗(yàn)以排除非結(jié)核分枝桿菌和牛結(jié)核分枝桿菌。H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。

2.培養(yǎng)基與試劑：Mtb分離培養(yǎng)采用改良羅氏培養(yǎng)基(天津金章科技發(fā)展有限公司)；Mtb鑒定與藥敏試驗(yàn)培養(yǎng)基(珠海貝索生物技術(shù)有限公司)；PCR擴(kuò)增試劑為2×HotMaster Taq MasterMix (天根生化科技有限公司)；PCR擴(kuò)增引物合成(上海英駿生物有限公司)；溶菌酶、蛋白酶K、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、十二烷基磺酸鈉(SDS)等Mtb基因組提取試劑(美國(guó)Sigma公司)。

二、試驗(yàn)方法

1. Mtb基因組的提?。簭母牧剂_氏培養(yǎng)基斜面上挑取Mtb菌落轉(zhuǎn)移至裝有500 μl磷酸鹽緩沖液(PBS)的1.5 ml Eppendorf管中；細(xì)菌經(jīng)80 ℃，60 min滅活后，加入50 μl(10 mg/ml)的溶菌酶，37 ℃過(guò)夜孵育；分別加入70 μl 10%SDS和5 μl 10 mg/ml 蛋白酶K，70 ℃孵育10 min，然后分別加入100 μl 5 mol NaCl、100 μl CTAB與NaCl混合液和600 μl氯仿與異戊醇(24∶1)混合液，充分混勻Eppendorf管中的溶液，10 000×g離心10 min；轉(zhuǎn)移含有基因組的上清至另一個(gè)裝有500 μl預(yù)冷的異丙醇溶液的Eppendorf管。混勻后將Eppendorf管置于-20 ℃冰箱中至少30 min； 離心沉淀DNA并經(jīng)預(yù)冷的1 ml 70%乙醇洗滌后，用200 μl TE [Tris(三羥甲基氨基甲烷)與乙二胺四乙酸(EDTA)配制而成]緩沖液溶解基因組DNA。提取的基因組DNA在測(cè)定基因組含量后，置于-70 ℃環(huán)境保存。

2.藥敏試驗(yàn)：采用《分枝桿菌分離培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化操作程序及質(zhì)量保證手冊(cè)》推薦的比例法藥敏試驗(yàn)[8]。檢測(cè)的藥物包括異煙肼、利福平、鏈霉素、乙胺丁醇、氧氟沙星和卡那霉素，其在改良羅氏培養(yǎng)基的終濃度分別為0.2 μg/ml、40 μg/ml、4 μg/ml、2 μg/ml、4 μgml 和30 μg/ml。若耐藥百分比大于1%，判定為受試菌株耐藥。

3.北京基因型的鑒定：根據(jù)北京基因型Mtb的基因組特點(diǎn)，通過(guò)PCR試驗(yàn)分析菌株基因組在Rv2616至Rv2819(RD207)和Rv0071至Rv0074(RD105)區(qū)域的缺失情況。RD207缺失分析采用多重PCR方法[9]，RD105缺失分析采用Hanekom等[10]報(bào)道的方法。每批次PCR試驗(yàn)均以H37Rv標(biāo)準(zhǔn)菌株(非北京基因型)為對(duì)照，并設(shè)陰性對(duì)照和試劑空白對(duì)照。

4.北京基因型NTF區(qū)IS6110分析：NTF區(qū)IS6110分析采用Wada等[11]報(bào)道的方法。首先使用上游引物MDR-6： 5′-CCAGATATCGGGTGTGTCGAC-3′和下游引物MDR-6r：5′-TGCCGTTGTCGAAATCTAAACCC-3′分析NTF區(qū)是否存在IS6110，如果含有IS6110，則為現(xiàn)代株，其擴(kuò)增產(chǎn)物為1.5 kb；反之則為古代株，其擴(kuò)增產(chǎn)物為302 bp。然后采用上游引物MDR-7：5′-CGCGAGATCTCATCGACAACC-3′和下游引物MDR-7r：5′-GTACGAAACAGCACGGTGCGG-3′分析現(xiàn)代株NTF區(qū)IS6110的數(shù)量，根據(jù)PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度判斷IS6110的數(shù)量。W型北京株含有2個(gè)IS6110，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為1.5 kb。而普通的北京型現(xiàn)代株中僅含有1個(gè)IS6110，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為280 bp。25 μl PCR反應(yīng)體系中含有12.5 μl的Master Mix，0.4 μmol/L的引物，以及10～50 ng的基因組DNA。PCR反應(yīng)條件為95 ℃變性 5 min；94 ℃反應(yīng) 30 s，63 ℃ 反應(yīng)30 s，72 ℃反應(yīng) 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃反應(yīng) 10 min。

三、 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入，運(yùn)用SPSS 11.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。構(gòu)成比及率的比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、北京基因型及其亞型的流行

對(duì)Mtb的進(jìn)化研究發(fā)現(xiàn)，菌株基因組在RD207缺失后進(jìn)化為北京基因型，進(jìn)而該基因型又出現(xiàn)RD105的缺失。本研究中對(duì)816株臨床分離的Mtb菌株經(jīng)PCR擴(kuò)增RD207和RD105所在的區(qū)域，證實(shí)有764株Mtb為北京基因型Mtb，占臨床分離菌株的93.63%。在764株北京基因型Mtb中現(xiàn)代株為654株(85.60%)，古代株為110株(14.40%)。對(duì)現(xiàn)代株NTF區(qū)IS6110的數(shù)量進(jìn)一步分析，證實(shí)654株現(xiàn)代株中僅有1株Mtb在NTF區(qū)中含有2個(gè)IS6110，即W型菌株；其余菌株在NTF區(qū)只含有1個(gè)IS6110(圖1)。

M：DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：H37Rv(RD207無(wú)缺失，為非北京基因型)；2：臨床分離菌株(RD207缺失，為北京基因型)；3：H37Rv(RD105無(wú)缺失，為非北京基因型)；4：臨床分離菌株(RD105缺失，為北京基因型)；5：北京基因型菌株NTF區(qū)無(wú)IS6110(古代株)；6：北京基因型菌株NTF區(qū)含有IS6110(現(xiàn)代株)；7：北京基因型現(xiàn)代株NTF區(qū)僅含1個(gè)IS6110；8：北京基因型現(xiàn)代株NTF區(qū)含有2個(gè)IS6110(W型菌株)圖1 菌株RD207、RD105和NTF區(qū)IS6110數(shù)目分析的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

二、藥敏試驗(yàn)

52株非北京基因型菌株中，有9株耐至少一種抗結(jié)核藥物，其中2株單耐異煙肼，3株單耐鏈霉素，3株單耐氧氟沙星，另有1株為MDR菌株同時(shí)對(duì)鏈霉素、異煙肼和利福平耐藥。在764株北京基因型菌株中全敏感菌株為590株，至少耐一種藥的菌株為174株，耐藥菌株中MDR 46株，耐異煙肼菌株99株(包括MDR)，耐利福平菌株59株(包括MDR)，耐鏈霉素菌株124株，耐乙胺丁醇菌株30株，耐氧氟沙星菌株42株，耐卡那霉素菌株7株。研究中所發(fā)現(xiàn)的1株W型菌株為全敏感菌株。統(tǒng)計(jì)分析未發(fā)現(xiàn)北京基因型菌株與耐藥相關(guān)(表1)。

表1 天津市不同耐藥表型在北京與非北京基因型Mtb中的分布與比較

注 括號(hào)外數(shù)值為“株數(shù)”；括號(hào)內(nèi)數(shù)值為“耐藥率(%)”

三、古代和現(xiàn)代菌株與耐藥的關(guān)系

古代菌株中耐藥者占30.91%(34/110)，現(xiàn)代菌株中耐藥者占21.41%(140/654)，兩者比較，χ2=4.83，P<0.05；古代菌株中耐利福平者占14.55%，顯著高于現(xiàn)代菌株的6.57%(χ2=8.40，P<0.01)，26.36%的古代株異煙肼耐藥，顯著高于現(xiàn)代株中10.70%的異煙肼耐藥比例(χ2=20.47，P<0.01)。此外，耐乙胺丁醇的菌株在古代菌株中占8.18%，高于在現(xiàn)代菌株的3.21%(χ2=6.17，P<0.05)。古代與現(xiàn)代菌株中耐鏈霉素、氧氟沙星和卡那霉素的比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在MDR菌株中，古代菌株占13.64%(15/110)顯著高于現(xiàn)代菌株的4.74%(χ2=13.17，P<0.01)(表2)。

表2 天津市不同耐藥表型在北京基因型古代與現(xiàn)代Mtb菌株中的分布與比較

注 括號(hào)外數(shù)值為“株數(shù)”；括號(hào)內(nèi)數(shù)值為“耐藥率(%)”

討 論

全國(guó)范圍內(nèi)的研究表明，北京基因型Mtb占全部臨床分離菌株的62.2%，且北方高于南方[12]。在本研究中對(duì)菌株基因組中RD207和RD105片段缺失分析證實(shí)天津市93.63%的菌株為北京基因型，與之前關(guān)于北京基因型在這一地區(qū)的研究結(jié)果相符，說(shuō)明北京基因型Mtb在天津市廣泛傳播，是絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)菌株[9,13]。這一比例與我國(guó)黑龍江省報(bào)道的北京基因型菌株占臨床分離菌株的89.5%相近[14]。進(jìn)一步分析北京基因型菌株基因組NTF區(qū)中IS6110，85.60%(654/764)的菌株為現(xiàn)代菌株，但我國(guó)寧夏，現(xiàn)代菌株的比例僅為54.4%[15]。在日本，僅21.4%為北京基因型現(xiàn)代菌株[11]。由此可見(jiàn)，北京基因型進(jìn)化過(guò)程中所形成的不同亞型在不同地區(qū)的流行程度并不相同，本研究提示在北京基因型高流行地區(qū)，現(xiàn)代菌株可能更容易在人群中傳播。此外，在NTF區(qū)中含有2個(gè)IS6110的W型菌株被認(rèn)為是現(xiàn)代菌株中最新進(jìn)化的一個(gè)分支，但本研究?jī)H發(fā)現(xiàn)1株，說(shuō)明W型菌株在天津市并不是主要的流行菌株。

分子流行病學(xué)研究提示，一些地區(qū)北京基因型菌株與耐藥結(jié)核病的傳播相關(guān)，某些耐藥基因突變位點(diǎn)(如與異煙肼耐藥相關(guān)的KatG基因 315位點(diǎn))在北京基因型菌株中Ser→Thr的突變比例高于非北京基因型菌株[16]。在我國(guó)北京基因型菌株的大規(guī)模流行與耐藥結(jié)核病傳播之間的關(guān)系還需要進(jìn)一步研究。Pang等[12]的研究發(fā)現(xiàn)，流行的北京基因型Mtb可能與利福平、氧氟沙星耐藥菌株的傳播有關(guān)，還可能與MDR-TB的傳播相關(guān)。但另一項(xiàng)對(duì)我國(guó)6個(gè)省收集的菌株開(kāi)展的分子流行病學(xué)研究則未發(fā)現(xiàn)，北京基因型菌株中耐藥菌株的比例顯著高于非北京基因型菌株[17]，本研究中未發(fā)現(xiàn)耐藥菌株在北京與非北京基因型Mtb菌株中的比例差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

目前，全球多個(gè)地區(qū)的流行病學(xué)研究提示，較之其他基因型，北京基因型可能更容易對(duì)抗結(jié)核治療藥物產(chǎn)生耐藥，而耐藥則被認(rèn)為可能是促進(jìn)北京基因型廣泛傳播的主要因素之一[18]。但在本研究中，雖然古代菌株僅占北京基因型菌株的14.40%，但其中耐異煙肼者占26.36%，耐利福平者占14.55%，MDR菌株占13.64%，均顯著高于現(xiàn)代株。這一研究結(jié)果提示，北京基因型在進(jìn)化過(guò)程所產(chǎn)生的不同亞型中，古代株與耐藥結(jié)核病的關(guān)系更為密切，但導(dǎo)致古代耐藥菌株流行的機(jī)制還需要通過(guò)對(duì)臨床分離菌株開(kāi)展大規(guī)模的分子流行病學(xué)研究才能進(jìn)一步闡明。在人群中傳播更占優(yōu)勢(shì)的現(xiàn)代Mtb菌株其耐異煙肼、利福平和MDR的比例卻低于古代菌株，提示在天津這樣的北京基因型Mtb高流行地區(qū)，古代耐藥北京菌株產(chǎn)生的主要原因可能由于其本身更容易產(chǎn)生耐藥，而不是由于耐藥菌株在人群中的傳播所導(dǎo)致。菌株產(chǎn)生耐藥性可能并不是引起北京基因型流行的主要因素，其廣泛傳播的原因可能是由于其他的機(jī)制所導(dǎo)致。最新研究提示，現(xiàn)代北京基因型菌株的廣泛流行可能與以下兩個(gè)因素有關(guān)：一方面是BCG疫苗的接種，統(tǒng)計(jì)分析表明接種BCG疫苗的人群更容易感染現(xiàn)代菌株，提示現(xiàn)代菌株能夠更好地克服宿主接種BCG后所產(chǎn)生的免疫[19]；另一方面，現(xiàn)代菌株具有更強(qiáng)的抑制宿主的免疫應(yīng)答的能力。最近研究發(fā)現(xiàn)，古代菌株誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-8等細(xì)胞因子的水平明顯高于現(xiàn)代株[20]。

綜上所述，作為北京基因型Mtb的高流行地區(qū)，天津以現(xiàn)代株的流行為主，但現(xiàn)代株的一個(gè)重要分支——W型菌株并不是主要的流行株。北京基因型Mtb古代菌株與耐利福平、異煙肼等多種抗結(jié)核藥物具有顯著的相關(guān)性，而且在耐多藥菌株中古代菌株的比例顯著高于現(xiàn)代菌株。因此，今后有必要進(jìn)一步研究古代菌株易產(chǎn)生耐藥的機(jī)制，從而更好地遏制耐藥結(jié)核病的流行。同時(shí)本研究結(jié)果提示，在天津市耐藥并不是引起北京基因型Mtb在人群中廣泛傳播的主要原因。

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(本文編輯：范永德)

AncientMycobacteriumtuberculosisBeijing genotype clinical isolates are associated with drug resistance in Tianjin, China

XIETong*，JUHan-fang，WANGChun-hua，WANGZhi-rui，MUCheng，ZHAOHui，WANGYan-nan，SUNRui,WANGXie-xiu.
*TianjinCentersForDiseaseControlandPrevention，Tianjin300011，China

WANGXie-xiu，Email：wjsttigo@126.com

ObjectiveMycobacteriumtuberculosis(Mtb) Beijing genotype strains are globally distributed and have evolved a variety of sublineages. Based on the absence or presence of IS6110 insertions in the noise transfer function (NTF) chromosomal region, Beijing genotype strains can be divided into two sublineages, known as ancient (atypical) and modern (typical) strains. This study aimed to investigate the prevalence of Beijing sublineages and the relationship between these sublineages and drug-resistance. Methods A total of 816 clinical isolates of Mtb from 2012 to 2014 were used. Deletion of Region of difference (RD) 207 and RD105 was detected using PCR to identify Beijing genotype isolates. Numbers of IS6110 insertions in the NTF region in the Beijing strains were determined and the association between Beijing genotype sublineage and drug-resistance was analyzed. Results Of the 816 isolates examined, 764 (93.63%) strains belonged to the Beijing genotype. Of these, 110 (14.40%) were ancient strains, and 654 (85.60%) strains were modern strains. One modern strain belonged to W strain, which had two IS6110 insertions in the NTF region. Ancient Beijing strains were more highly represented than modern Beijing stains among isoniazide-resistant (26.36% vs 10.70%,χ2=20.47,P<0.01), rifampin-resistant (14.55% vs 6.57%,χ2=8.40,P<0.01) and ethambutol-resistant (8.18% vs 3.21%,χ2=6.17,P<0.05) strains. Proportions of ancient Beijing strains were significantly higher than those of modern Beijing stains among MDR-TB strains (13.64% vs 4.74%,χ2=13.17,P<0.01). Conclusion Modern Beijing strains are predominant in China, and ancient Beijing strains exhibit a greater association with drug resistance. Our findings imply that drug resistance may not be the major factor driving Beijing genotype transmission in Tianjin, China.

Mycobacteriumtuberculosis； Genotype； Drug resistance,bacterial； Phenotype

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.09.003

國(guó)家自然科學(xué)基金(81172736)

300011 天津市疾病預(yù)防控制中心(謝彤、王志銳、王擷秀)；天津市結(jié)核病控制中心結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室(巨韓芳、王春花、穆成、趙慧、王艷楠、孫蕊)

王擷秀，Email: wjsttigo@126.com

2015-03-03)