張曉芬，冶貴生，馬玉花，賀曉龍，康 明，張 爽，韓志輝，賈躍寧，張洪波

（青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海西寧810016）

藏羊（Tibetan sheep）是青藏高原優(yōu)勢畜種之一，藏羊有較強(qiáng)的抗病力［1］，這種特性與其免疫基因密切相關(guān)。主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatility complex，MHC）是脊椎動物中與免疫相關(guān)的一個高度緊密連鎖的基因群，控制著動物機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的能力。綿羊的MHC又稱為綿羊淋巴細(xì)胞表面抗原（ovine lymphocyte antigen，OLA），分為Ⅰ類、Ⅱ類和Ⅲ類，具有提呈外源性抗原物質(zhì)給輔助T 淋巴細(xì)胞，觸發(fā)免疫應(yīng)答的作用［2］。OLAⅡ類分子上只有OLADR和OLA－DQ 基因能夠在蛋白質(zhì)水平上表達(dá)，DR亞區(qū)和DQ 亞區(qū)的DRB和DQB兩個基因的第2外顯子編碼抗原結(jié)合區(qū)，是組成OLAⅡ類分子功能最重要的部分［3］。OLAⅡ分子與綿羊的寄生蟲病、腐蹄病等疾病抗性相關(guān)，申紅等［4］采用PCR－RFLP方法研究了多浪羊MHC－DQB1基因外顯子2多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)MvaⅠD可能為多浪羊包蟲病的抗性基因。杜迎春等［5］研究表明中國美利奴羊DQB1抗性單倍型綿羊?qū)?xì)粒棘球絳蟲的抵抗力顯著高于非抗性綿羊。劉秀等［6］檢測了216 只表型正常和患腐蹄病藏綿羊OLADQA2基因第2外顯子的多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)在未患腐蹄病的羊只中，等位基因DQA2＊F和＊L頻率較高，推斷等位基因DQA2＊F和＊L具有較強(qiáng)的抵抗腐蹄病的遺傳潛力。目前關(guān)于藏羊OLAⅡ類分子的報道較少，僅見于藏羊OLA－DQA 和OLA－DRB基因的研究，未見藏羊DQB1基因編碼蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測方面的報道。因此，本研究在前期獲得藏羊DQB1基因序列的基礎(chǔ)之上，對藏羊DQB1基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，旨在為青海藏羊DQB1基因抗病性的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

藏羊DQB1基因序列來源于前期研究工作［7］。利用DNA Star生物軟件中的Ⅰ－Tasser、SignalP4.1、PredictProtein和TMHMM 在線服務(wù)器。

1.2 方法

采用DNA Star軟件中Garnier J等［8－10］的方法預(yù)測藏羊DQB1蛋白的α螺旋、β折疊、β轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲和柔韌性等二級結(jié)構(gòu)。采用DNA Star軟件中Kyte J等［11］的方法預(yù)測DQB1蛋白的疏水性。采用SignalP4.1在線服務(wù)器預(yù)測DQB1蛋白的信號肽。采用TMHMM 在線服務(wù)器預(yù)測DQB1蛋白的跨膜螺旋區(qū)。采用PredictProtein在線服務(wù)器預(yù)測DQB1蛋白的修飾位點(diǎn)。采用Ⅰ－Tasser在線服務(wù)器預(yù)測DQB1蛋白的三級結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 DQB1蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

Garnier等方法預(yù)測結(jié)果表明（圖1），DQB1蛋白二級結(jié)構(gòu)中α螺旋占0.383%；β折疊占62.8%，在整個肽段中分布較多也較均勻，主要區(qū)域?yàn)?－10、14－26、38－42、46－49、55－63、67－72、88－91、99－104、106－111、116－121、128－134、138－141、146－155、158－164、171－181、186－195、202－209、216－220、229－253、258－261 位 氨 基 酸；β轉(zhuǎn)角占18%，主要區(qū)域?yàn)?12－115、142－145、197－201、254－257位氨基酸；無規(guī)則卷曲占19.2%，主要區(qū)域?yàn)?2－13、27－28、30－31、35－36、50－54、64－66、82－85、94－95、97－98、135－137、165－170、184－185、213－215、221－226位氨基酸。

Chou等方法預(yù)測結(jié)果表明（圖1），DQB1蛋白二級結(jié)構(gòu)中α螺旋占19.5%，分布區(qū)域?yàn)?－8、65－72、88－92、98－110、138－144、216－222、227－233位氨基酸；β折疊占45.6%，分布較多，主要區(qū)域?yàn)?3－25、40－48、53－63、79－83、115－117、120－133、145－154、158－164、171－181、186－194、201－208、238－252、257－261 位 氨 基 酸；β轉(zhuǎn)角占29.1%，主要區(qū)域?yàn)?－4、9－12、27－30、32－39、49－52、73－76、84－87、94－97、111－114、134－137、155－158、165－168、182－185、197－200、209－212、223－226、234－237、253－256位氨基酸。

Karplus等方法預(yù)測結(jié)果表明（圖1），DQB1蛋白柔韌性區(qū)域較豐富，主要分布區(qū)為10－12、26－38、50－55、66－68、73－77、83－90、94－98、107－108、125－131、133－139、153－160、165－172、176－185、196－201、210－216、222－231、233－236、254－258位氨基酸。

2.2 DQB1蛋白疏水性預(yù)測

Kyte－Doolittle 方 法 預(yù) 測 結(jié) 果 顯 示（圖2），DQB1蛋白具有一定的疏水性，主要分布區(qū)為1－28、42－47、144－153、175－179、186－194、214－216、231－251位氨基酸。

圖1 DQB1蛋白二級結(jié)構(gòu)Fig.1 Second structure of DQB1protein

圖2 DQB1蛋白疏水性Fig.2 Hydrophobicity plot of DQB1protein

2.3 DQB1蛋白信號肽預(yù)測

應(yīng)用Signal IP在線軟件對DQB1蛋白進(jìn)行信號肽預(yù)測，結(jié)果表明（圖3），DQB1蛋白具有信號肽。

2.4 DQB1蛋白跨膜螺旋區(qū)預(yù)測

應(yīng)用TMHMM 在線軟件對DQB1蛋白進(jìn)行跨膜螺旋區(qū)的預(yù)測，結(jié)果表明（圖4），DQB1 蛋白有1個跨膜螺旋區(qū)，位于肽鏈的232－251位氨基酸。

2.5 DQB1蛋白修飾位點(diǎn)預(yù)測

應(yīng)用PredictProtein在線軟件對DQB1蛋白進(jìn)行修飾位點(diǎn)預(yù)測，結(jié)果表明該蛋白含有1個N－糖基化位點(diǎn)，為51－54位的NGTE；5個蛋白激酶C 磷酸化位點(diǎn)，分別為53－55位的TER、95－97位的SQK、171－173位的TAR、204－206位的TCR、255－257位的SQK；4個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)，分別為35－38 位 的SPQD、95－98 位 的SQKD、136－139 位 的SRTE、150－153位的SVTD；1個酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)，為71－79位的RFDSDWGEY；2個N－豆蔻?；稽c(diǎn)，分別為12－17 位的GLWTAA、86－91 位的GQRQAE；1 個細(xì)胞附著序列，為199－201 位的RGD；1個免疫球蛋白和主要組織相容性復(fù)合體蛋白，為203－209位的YTCRVEH。

2.6 DQB1蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

應(yīng)用Ⅰ－Tasser在線軟件對DQB 蛋白進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)預(yù)測后得到5種模型（圖5），這5種模型的C－score值均在［－5，2］的置信區(qū)間內(nèi)（模型1：Cscore＝－1.04，模型2：C－score＝－1.78，模型3：Cscore＝－2.54，模型4：C－score＝－2.44，模型5：Cscore＝－3.30），主要以α螺旋、β折疊和無規(guī)則卷曲組成。模型1相對于其他4個模型而言，C－score值最大，可信度較高。

圖3 DQB1蛋白信號肽Fig.3 Signal peptide of DQB1protein

圖4 DQB1蛋白跨膜螺旋區(qū)Fig.4 Transmenbrane helical area of DQB1protein

圖5 DQB1蛋白三級結(jié)構(gòu)Fig.5 Tertiary structure of DQB1protein

3 討論

MHCⅡ類分子在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮抗原提呈的作用，外源性抗原被抗原提呈細(xì)胞（antigen presenting cell，APC）通過吞噬、受體介導(dǎo)的內(nèi)吞或胞飲作用攝入胞內(nèi)，與內(nèi)體融合后被轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體。MHCⅡ類分子在APC內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中被合成，進(jìn)入高爾基體中被修飾后，在內(nèi)吞系統(tǒng)與外源性抗原相遇，進(jìn)入溶酶體后結(jié)合抗原肽形成復(fù)合物，該復(fù)合物通過胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)或胞吐作用表達(dá)于APC表面，并被提呈給CD4＋T 細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR）識別，使CD4＋T 細(xì)胞活化和增殖，觸發(fā)細(xì)胞免疫反應(yīng)［12］。DQB1基因作為MHCⅡ類分子的一種亞基，在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用。本研究通過對藏羊DQB1蛋白進(jìn)行信號肽預(yù)測，結(jié)果表明該蛋白具有信號肽，這說明該蛋白可能是在信號肽的引導(dǎo)下進(jìn)入APC內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，從而結(jié)合外源性抗原肽起到抗原提呈的作用。DQB1蛋白有一個跨膜螺旋區(qū)，位于肽鏈的232－251位氨基酸，由于DQB1蛋白需穿過APC膜的磷脂雙層，跨膜區(qū)須由疏水性氨基酸組成，DQB1蛋白疏水性預(yù)測結(jié)果顯示在231－251位有一個疏水區(qū)，這與跨膜螺旋預(yù)測結(jié)果相符。藏羊DQB1蛋白預(yù)測后有7種修飾位點(diǎn)，蛋白N－糖基化（（N－glycosylation）對于蛋白質(zhì)的折疊、運(yùn)輸、定位起著重要作用［13］，推測DQB1蛋白進(jìn)入APC內(nèi)質(zhì)網(wǎng)后經(jīng)N－糖基化完成MHC多肽復(fù)合物的加工。DQB1蛋白除了有N－糖基化修飾外還是多種激酶的底物，蛋白激酶C（protein Kinase C，PKC）是一種重要的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)，對T 淋巴細(xì)胞的活化有著重要的調(diào)控作用［14］；酪蛋白激酶Ⅱ（casein kinaseⅡ）通過對底物的磷酸化在細(xì)胞增殖與分化、信號傳導(dǎo)、細(xì)胞凋亡等方面起著重要的作用［15］；蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase，PTK）是信號傳遞過程中的重要因子［16］，推測這3種激酶被激活后可能參與了DQB1蛋白在提呈抗原過程中的信號傳遞。N－豆蔻?；∟－myristoylation）能夠調(diào)節(jié)蛋白與膜的可逆性結(jié)合，豆蔻酸與一些水溶性蛋白共價結(jié)合，使得這些水溶性蛋白被錨定在質(zhì)膜的細(xì)胞質(zhì)面成為膜蛋白［17］，推測DQB1蛋白可能經(jīng)豆蔻化后定位于膜上，從而將抗原多肽復(fù)合物遞呈給輔助T 淋巴細(xì)胞并活化CD4＋T細(xì)胞，最終觸發(fā)免疫應(yīng)答。

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