劉 祥，劉 蘭，趙 琴，仲英娜

HLA-DP、C基因多態(tài)性與新疆維吾爾族HBV感染的相關(guān)性研究

劉 祥1，2，劉 蘭2，趙 琴2，仲英娜1，2

目的探討人類白細胞抗原（HLA）基因多態(tài)性與新疆維吾爾族人群乙型肝炎病毒（HBV）感染后病毒自然清除的關(guān)聯(lián)。方法收集新疆維族HBV持續(xù)感染者245例（128例慢性乙肝患者，117例乙肝無癥狀攜帶者）和150例HBV感染自發(fā)清除者（對照組），對HLA基因2個位點和UBE基因1個位點進行測序分析，比較HBV組與對照組HLA基因型頻率和等位基因頻率的差異。結(jié)果①HLA-DP rs9277535AA型頻率在HBV組中明顯少于對照組（P＝0.023），G等位基因在兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0.020）；HLA-C rs3130542GG型和A等位基因在HBV組和對照組中差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）；UBE2L3 rs4821116基因型頻率和等位基因頻率在兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）；②rs9277535A和rs3130542G構(gòu)成了相對降低HBV感染風(fēng)險的單倍型，rs9277535G和rs3130542A構(gòu)成了相對提高HBV感染風(fēng)險的單倍型；③維吾爾族人群HLA保護性等位基因頻率高于漢族和藏族人群。結(jié)論HLA-DP rs9277535、HLA-C rs3130542多態(tài)性與新疆維吾爾族人群HBV感染后結(jié)局有關(guān)；HLA保護性等位基因頻率越高的人群，其HBV感染后的自然清除率越高。

人類白細胞抗原；乙型肝炎病毒；維吾爾族；基因多態(tài)性

根據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，目前全世界范圍內(nèi)有超過20億人感染過乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV），其中4億為慢性乙型肝炎感染者，每年約有120萬人死于乙肝相關(guān)疾?。?－2］。全基因組關(guān)聯(lián)研究［3］表明人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）單核苷酸多態(tài)性與HBV感染結(jié)局相關(guān)，在國內(nèi)漢族人群的研究［4］證實HLA基因多態(tài)性與HBV感染自發(fā)清除者密切相關(guān)。HBV感染后的結(jié)局與不同種族間的遺傳差異和宿主因素有關(guān)［5－6］。為弄清維吾爾族人群HBV感染后的不同結(jié)局是否與HLA基因多態(tài)性有關(guān)，該研究選取新疆維吾爾族HBV持續(xù)感染者和HBV感染自然清除者共395例受試者，對HLA以及UBE 3個位點進行測序分析，探討維吾爾族HBV感染后不同感染結(jié)局的遺傳因素。

1 材料與方法

1.1 病例資料本研究共受試者均為新疆維吾爾族，共395例（其中128例慢性乙肝患者及117例乙肝無癥狀攜帶者作為HBV組，150例HBV感染自發(fā)清除者作為對照組），受試者均來自2012年7月～2014年7月在新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院肝病中心住院或門診患者。其中HBV持續(xù)感染者要求血清乙肝表面抗原陽性（HBsAg＋）6個月以上，而乙肝表面抗體陰性（HBsAb－），影像學(xué)和實驗室檢測無肝硬化和肝臟腫瘤的癥像，納入HBV組，其中乙肝病毒核酸（HBV-DNA）陽性且肝功能異常為慢性乙肝患者128例，其余117例為HBV無癥狀攜帶者）。HBV感染自發(fā)清除者要求血清乙肝表面抗原陰性（HBsAg－），表面抗體（HBsAb）和核心抗體（HBcAb）陽性；或乙肝表面抗體陽性（HBsAb＋）但無乙肝疫苗接種史，均被納入對照組。兩組人群均排除甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁性肝炎病毒或人類免疫缺陷病毒感染的患者或其他感染性疾病的患者，及合并自身免疫性疾病、嚴重精神性疾?。ㄈ缫钟舭Y）、惡性腫瘤、甲狀腺疾病患者、有吸毒或酗酒史的患者等。受試者均來自新疆維吾爾自治區(qū)，無民族間遺傳干擾（家族成員與其他民族人無通婚情況）、連續(xù)兩代及以上長期居住于新疆的維吾爾族人群，均簽署書面知情同意書，該研究由新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，符合倫理審查標(biāo)準(zhǔn)，符合赫爾辛基宣言。

1.2 研究方法HLA-DP rs9277535、HLA-C rs3130542和UBE2L3 rs4821116基因單核苷酸多態(tài)性被證實與HBV感染結(jié)局有關(guān)，故選取上述3個SNP位點進入本實驗。本研究采用病例對照研究，采集受試者外周靜脈血（抗凝），使用基因組DNA

提取試劑盒（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司）提取DNA。PCR擴增各個基因位點，35 μl PCR反應(yīng)體系：2×Taq PCR mix 25 μl，10 μmol／L上下游引物各1 μl，模板1 μl，超純水補足至50 μl。所用試劑購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸60 s，共35個循環(huán)；然后72℃延伸10 min，最后4℃保存。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，判定PCR產(chǎn)物擴增出目的條帶的質(zhì)量。PCR產(chǎn)物由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司測序。實驗室數(shù)據(jù)（乙肝三系、HBVDNA、肝功能等）由新疆自治區(qū)人民醫(yī)院臨床檢驗中心檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 13.0和SHEsis軟件進行分析。Hardy-Weinberg平衡定律檢驗對每位點進行平衡性評價；滿足正態(tài)分布的兩組間均數(shù)比較采用t檢驗，非正態(tài)分布資料應(yīng)用Mann-Whitney U-t檢驗；組間等位基因和基因型頻率在HBV組和對照組中的分布差別使用χ2檢驗或Fisher’s精確檢驗；基因型和等位基因與疾病的關(guān)聯(lián)強度用比值比（odd ratio，OR）和95%可信區(qū)間（95%CI）表示。單倍型分析用于確定所選定的SNP是否具有連鎖不平衡，篩選比單個SNP關(guān)聯(lián)性更強的單倍型。

2 結(jié)果

2.1 HBV組與對照組兩組患者臨床資料HBV組包括慢乙肝組和HBV無癥狀攜帶者組，對照組為HBV病毒清除組；兩組患者的性別（χ2＝0.436，P＝0.756）、年齡（t＝1.378，P＝0.512）及體重指數(shù)（body mass index，BMI）（t＝2.654，P＝0.227）等一般資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義。HBV組和對照組中男性患者比例均高于女性；兩組受試者年齡的中位數(shù)分別為37歲和35歲。乙肝e抗原（HBeAg）陽性受試者在HBV組占60.4%，高于陰性受試者。所有檢測的多態(tài)性位點其基因型和等位基因頻率在人群中分布符合Hardy-Weinberg平衡定律（P＞0.05）。見表1。

2.2 各位點基因型和等位基因頻率在兩組受試者中的分布及相關(guān)分析HLA-DP rs9277535中AA型與非AA型在兩組中有明顯的差異（OR＝0.52，95%CI：0.29～0.92，P＝0.023）；攜帶G等位基因可能增加HBV感染后持續(xù)感染的風(fēng)險（OR＝0.46，95%CI：0.21～0.93，P＝0.020）。HLA-C rs3130542在兩組中的差異最為明顯，A等位基因頻率在HBV組中占30.4%，明顯高于對照組（13.3%），A等位基因可能增加HBV持續(xù)感染的風(fēng)險（OR＝1.48，95%CI：1.24～1.77，P＜0.001）；基因型頻率同樣差距明顯（OR＝2.24，95%CI：1.52 ～4.26，P＜0.001）。UBE2L3 rs4821116其基因型和等位基因頻率在兩組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。見表2。

2.3 慢乙肝組和HBV無癥狀攜帶者組基因型頻率、等位基因頻率的比較將HBV組分為慢乙肝組和HBV無癥狀攜帶者組進行分析，受測的3個位點在兩組間的基因型和等位基因頻率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

2.4 單倍型分析 對于HBV自然清除有統(tǒng)計學(xué)意義的2個HLA位點進行配對連鎖不平衡分析，結(jié)果顯示rs9277535和rs3130542存在連鎖不平衡，進行單倍體分析顯示這2個位點組成的rs9277535A／rs3130542G單倍型相對降低HBV持續(xù)感染風(fēng)險（χ2＝6.251，P＝0.018），而rs9277535G／rs3130542A組成的單倍型則增加了HBV持續(xù)感染的風(fēng)險（χ2＝6.677，P＝0.012）。見表4。

表1 兩組患者一般臨床資料

表2 各位點基因型和等位基因頻率在兩組中的分布［n（%）］

表3 各位點在慢乙肝和HBV無癥狀攜帶者兩組中的分布［n（%）］

表4 rs9277535和rs3130542兩位點的單倍體型關(guān)聯(lián)分析

2.5 國內(nèi)不同民族HLA等位基因頻率比較將維吾爾族HLA保護性基因頻率與漢族以及藏族人群比較，維吾爾族人群rs9277535保護性等位基因A頻率高于藏族人群［8］（χ2＝1.516，P＝0.029）和漢族人群［4］（χ2＝2.233，P＝0.046）；rs3130542維吾爾族人群保護性等位基因頻率與漢族人群基本相當(dāng)（χ2＝0.127，P＝0.361）。由此可見，維吾爾族人群HLA-DP rs9277535保護性等位基因頻率要高于漢族和藏族人群。見表5。

3 討論

HLA-DP rs9277535G等位基因最早被認為增加了漢族人群HBV持續(xù)感染的風(fēng)險，而A等位基因有助于病毒的清除［7］。研究顯示上述HLA位點與新疆維吾爾族人群HBV感染后自發(fā)清除有關(guān)，這是首次顯示rs3130542位點多態(tài)性與新疆維吾爾族HBV感染自發(fā)清除有關(guān)，其基因型頻率和等位基因頻率在HBV組和對照組間的差異較其他位點更為明顯（P＜0.001），可能更適合于預(yù)測維吾爾族人群的HBV感染的預(yù)后。對上述位點進行連鎖不平衡分析顯示，rs9277535與rs3130542存在顯著的連鎖不平衡關(guān)系，構(gòu)成了相對保護性單倍型rs9277535A／rs3130542G和相對危險性單倍型rs9277535G／rs3130542A。日本學(xué)者最早發(fā)現(xiàn)HLADQrs7453920與HBV感染清除有關(guān)［3］；研究［8］顯示rs3077、rs7453920和rs9277535與中國藏族、維吾爾族等HBV感染自然清除有關(guān)。

表5 HLA保護性等位基因在國內(nèi)不同種族中的分布（%）

HLA基因多態(tài)性影響HBV感染預(yù)后的機制目前尚未明確，研究［9］顯示正常肝組織中HLA-DP分子可表達信使RNA（mRNA），而mRNA在抗感染免疫過程中有重要作用，攜帶HLA-DP風(fēng)險等位基因（rs9277535G）會導(dǎo)致HLA-DP的mRNA水平表達下降，從降低機體自發(fā)清除病毒的能力；而HLA-C基因編碼一類I型HLA分子，肝細胞內(nèi)HLA-C分子的表達增加會刺激細胞毒性T細胞（cytotoxic T cell，CTLs）的攻擊作用［10］，這一機制也是HBV感染后病毒清除的一個關(guān)鍵部分［11］，HBV感染自發(fā)清除者具有較為強烈的CTLs反應(yīng)從而達到清除病毒的作用［12］，攜帶rs3130542 A等位基因的患者肝臟內(nèi)HLA-C分子的表達較少，CTLs反應(yīng)相對較弱無法達到清除病毒的作用，導(dǎo)致HBV持續(xù)感染的風(fēng)險增加［13］。HLA多態(tài)性在HBV感染自發(fā)清除中的作用機制仍是目前研究重點。

慢性乙肝的發(fā)病率在不同地區(qū)和人群中是不同的。中國西北地區(qū)的維吾爾族人群HBsAg陽性率大約為4%～5%，居住在中國西南、中南以及東部的漢族人群陽性率高達7%，甚至超過8%［14］；西南地區(qū)藏族人群大約為5.8%［15］。核心抗體的陽性率（表示HBV的暴露率）在維吾爾族和漢族人群分別是43.1%、44.2%，藏族人群的僅為24.6%。表明相比于藏族和漢族人群，維吾爾族人群HBV感染后發(fā)展為慢性感染者的概率低，其自發(fā)清除率高。推測，這一差異與不同人群遺傳背景有關(guān)，維吾爾族人群相比漢族和藏族人群其HBV感染后自發(fā)清除方面有更為優(yōu)勢的遺傳背景，本研究顯示新疆維吾爾族人群HLA保護性基因頻率要高于漢族和藏族人群，即其擁有高頻率的保護性基因?qū)е缕銱BV感染后的自發(fā)清除率也升高，這可能就是維吾爾族人群在HBV感染后的遺傳背景優(yōu)勢所在。這些現(xiàn)象揭示了HLA基因多態(tài)性與HBV感染自然清除存在密切關(guān)聯(lián)。

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Association of human leukocyte antigen variants with hepatitis B virus infection in Uygurs population in China

Liu Xiang1，2，Liu Lan2，Zhao Qin2，et al
（1The Affiliated Xinjiang Hospital of Anhui Medical University，2People’s Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region，Urumchi 830001）

ObjectiveTo invest the associations of human leukocyte antigen polymorphism with the HBV viral clearance in Uygur population of Xinjiang.Methods245 Uygur HBV carriers（128 chronic HBV carriers and 117inactive carriers）and 150 Uygur controls（naturally cleared the HBV virus）were recruited.Three single nucleotide polymorphisms（SNP）were genotyped.Results①The frequency of HLA-DP rs9277535AA type in HBV carriers group was significantly lower than controls（P＝0.023）.The frequency of A allele distribution in controls was significantly higher than in carriers（P＝0.020）.The frequency of HLA-C rs3130542GG type and A allele were different between HBV carriers and controls（P＜0.001）.The frequency of UBE2L3 rs4821116AA type and G allele were not significantly different between HBV carriers and controls（P＞0.05）.②We found that rs9277535 and rs3130542 were in linkage disequilibrium，and the rs9277535A／rs3130542G type was a possible protective factor of HBV，while rs9277535G／rs3130542A type in the subjects was a relative risk.ConclusionHLA-DP rs9277535，HLA-C rs3130542 gene polymorphisms are associated with the outcomes of hepatitis B virus infection in Uygur population of Xinjiang in China.The more frequency of HLA protective alleles，the higher rate of HBV natural clearance.

HLA；hepatitis B virus；uygur；gene polymorphisms

R 512.62；R 394.3

A

1000－1492（2015）07－1020－05

2015－03－17接收

新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院院內(nèi)科研項目（編號：20120115，20140132）

1安徽醫(yī)科大學(xué)新疆臨床學(xué)院，2新疆自治區(qū)人民醫(yī)院感染科，烏魯木齊830001

劉 祥，男，碩士研究生；仲英娜，女，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：zhongyn2005＠126.com