苘娜娜馬煥艷魯華云倪春霄孟祥坤余榮峰魯興萌

（1杭州市種子總站，浙江杭州 310020；2浙江大學(xué)蠶蜂研究所，浙江杭州 310058；3

淳安縣繭絲綢總公司，浙江淳安 311700）

不同分子類型家蠶病原性白僵菌的分離及致病性試驗(yàn)

苘娜娜1馬煥艷2魯華云1倪春霄1孟祥坤2余榮峰3魯興萌2

（1杭州市種子總站，浙江杭州 310020；2浙江大學(xué)蠶蜂研究所，浙江杭州 310058；3

淳安縣繭絲綢總公司，浙江淳安 311700）

基于家蠶白僵病在部分蠶區(qū)季節(jié)性流行較為嚴(yán)重的現(xiàn)象，為了解家蠶病原性白僵菌在養(yǎng)蠶生產(chǎn)中是否存在菌種多樣性或存在主流菌種，從浙江省淳安縣（CA）、桐鄉(xiāng)市（TX）、臨安市（LA）和桐廬縣（TL）蠶區(qū)采集的86份白僵病蠶或病蛹樣品中分離得到53個(gè)菌株；通過核糖rDNA內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列分析和形態(tài)學(xué)觀察確認(rèn)，有47個(gè)分離菌株為球孢白僵菌屬，3個(gè)為蠟蚧屬，3個(gè)為擬青霉屬；對ITS序列存在差異的7個(gè)分離菌株進(jìn)行家蠶致病力試驗(yàn)，結(jié)果顯示，不同菌株對家蠶的致病力存在一定差異，家蠶致病力依次為CA-12（球孢白僵菌屬，76.67%）＞CA-15（球孢白僵菌屬，53.33%）＞TX-1（蠟蚧屬，28.33%）＞CA-1（球孢白僵菌屬，16.67%）＞CA-6（擬青霉屬，10.00%）＞TX-12（蠟蚧屬，0）＝TX-13（0，蠟蚧屬），球孢白僵菌株對家蠶的致病力最強(qiáng)，病勢也最急，其他菌株對家蠶的致病力有高有低；推測家蠶白僵病致病性菌種呈多樣性，試驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步研究家蠶白僵病的防控提供了參考依據(jù)。

家蠶；白僵菌；菌株；ITS序列分析；致病力

家蠶白僵病是養(yǎng)蠶生產(chǎn)上一種常見且危害嚴(yán)重的寄生性真菌蠶病，在我國江蘇、浙江、廣西、廣東等主要蠶區(qū)都曾嚴(yán)重暴發(fā)［1-4］，導(dǎo)致蠶繭大幅減產(chǎn)甚至絕收。球孢白僵菌［Beauveria bassiana（Bals）Vuill，以下簡稱白僵菌］是該病的主要病原。白僵菌寄主范圍非常廣，可寄生15個(gè)目700多種昆蟲及螨類［5］，家蠶等鱗翅目昆蟲也是白僵菌易感宿主。白僵菌具有極其豐富的遺傳多樣性［6-7］和種群異質(zhì)性［8］，不同菌株的生態(tài)習(xí)性及對寄主昆蟲的致病力都存在較大的差異［9］；因此，開展白僵菌分類研究具有重要意義。傳統(tǒng)上的白僵菌分類主要是依據(jù)分生孢子和產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)的形態(tài)特征，但對于形態(tài)特征不明顯的菌株，若用傳統(tǒng)的方法又很難準(zhǔn)確鑒定［10］。目前隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，利用核糖rDNA內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internal Transcribed Spacer ITS）序列測定，能實(shí)質(zhì)性地反映出屬間、種間以及菌株間的堿基對差異而成為真菌分類研究的一項(xiàng)重要技術(shù)手段［11］。

本研究從浙江省淳安縣、桐鄉(xiāng)市、臨安市和桐廬縣等蠶區(qū)采集的白僵病蠶或僵蛹中分離出菌株，通過ITS序列分析、形態(tài)學(xué)觀察及家蠶致病力試驗(yàn)，尋求養(yǎng)蠶生產(chǎn)中是否存在白僵菌主流菌種，或存在菌種多樣性，以期為家蠶白僵病的防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試白僵蠶或僵蛹：2010年在春蠶和夏蠶的5齡僵蠶或僵蛹中采集樣品，從淳安縣采集21份，桐鄉(xiāng)市采集36份，臨安市采集9份，桐廬縣采集20份，共計(jì)86份。樣品采集后裝袋、按地區(qū)編號（淳安縣樣品代號為“CA-X”，X＝1～21份；桐鄉(xiāng)市樣品代號為“TX-X”，X＝1～36份；臨安市樣品代號為“LA-X”，X＝1～9份；桐廬縣樣品代號為“TL-X”，X＝1～20份）；放入冰箱中4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

對照菌株：以本實(shí)驗(yàn)室保存的已確定種名的球孢白僵菌（BJ）為對照。

蠶品種：菁松×皓月，由桐鄉(xiāng)市蠶業(yè)有限公司生產(chǎn)，在浙江大學(xué)家蠶病理學(xué)與病害控制研究室飼養(yǎng)至2齡起蠶備用。

主要試劑和儀器：DNA buffer（含Mg2＋）、dNTP、Taq酶、PCR產(chǎn)物回收試劑盒、DNA marker、蛋白酶K等，購自寶生物工程（大連）有限公司；PCR所需引物，由生工生物工程（上海）有限公司合成；酸化玻璃珠（直徑425～600μm），購自Sigma公司（美國）；氯化芐、醋酸鈉（NaAc）等其它化學(xué)試劑，均為國產(chǎn)或進(jìn)口的分析純；培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）?？焖俸怂崽崛xFastPrep-24，由美國Bio-Rad公司生產(chǎn)；PCR儀Veriti 96，由美國Ap?plied Biosystems公司生產(chǎn)；數(shù)碼顯微鏡三維分析系統(tǒng)VHX-900，由日本KEYENCE公司生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 白僵菌菌株分離與鑒定 將采集的86份白僵病蠶或僵蛹的樣品及對照菌株BJ，參照文獻(xiàn)［12-13］的方法對白僵蠶或僵蛹樣品菌株進(jìn)行分離和鑒定，菌株編號沿用初始樣品編號。

1.2.2 分離菌株基因組DNA的提取 參照氯化芐提取白僵菌基因組DNA的方法［14］提取分離菌株基因組DNA，并做了適當(dāng)改進(jìn)。改進(jìn)之處是取新鮮氣生菌絲使用酸化玻璃珠破碎法振蕩，以及在提取過程中加入蛋白酶K。具體步驟：刮取培養(yǎng)皿內(nèi)分離菌株的純培養(yǎng)物（氣生菌絲），加0.5 mL DNA提取液（100 mmol／L Tris-Cl、40 mmol／L EDTA），0.1 mL 10%十二烷基磺酸鈉（SDS），0.3 mL氯化芐，2倍菌絲體積的酸化玻璃珠混合。使用快速核酸提取儀4 000 r／min劇烈振蕩40 s×5次，使管內(nèi)混合物呈乳狀；加2μL濃度為20 mg／mL的蛋白酶K后50℃溫浴1 h；冷卻至室溫后，加入0.3 mL預(yù)冷的3 mol／L醋酸鈉（NaAc，pH 5.2）溶液，混勻后冰浴15 min，4℃8 000 r／min離心15 min；取上清液移至新EP管中，加入等體積-20℃預(yù)冷的異丙醇于室溫沉淀30 min，4℃12 000 r／min離心15min，沉淀用-20℃預(yù)冷的75%乙醇洗滌1次，干燥后溶于200μL雙氧水（ddH2O）中；加2μL濃度為10 mg／mL的RNA酶，37℃水浴1 h；加入等體積的Tris飽和酚，4℃12 000 r／min離心10 min；取上清加入等體積酚—氯仿—異戊醇（25∶24∶1）4℃12 000 r／min離心10 min；取上清加入等體積氯仿—異戊醇（24∶1）4℃12 000 r／min離心10 min；取上清移至新EP管中加入1／10體積濃度為3 mol／L的NaAc（pH 5.2），再加入等體積-20℃預(yù)冷的異丙醇，放入-20℃冰箱使DNA沉淀30 min；4℃12 000 r／min離心10min，沉淀用75%預(yù)冷的乙醇4℃6 000 r／min離心3 min，洗滌2次，待乙醇揮發(fā)完全后，加100μL ddH2O溶解沉淀物，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR擴(kuò)增及測序 采用真菌通用引物［15］ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）和ITS5（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）進(jìn)行擴(kuò)增，由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。PCR反應(yīng)體系（50μL）：0.5μL Taq酶，5μL 10×PCR buffer（含Mg2＋），2μL濃度為2.5 mmol／L的dNTP，1μL模板DNA，引物各0.5μL，40.5μL雙蒸水。擴(kuò)增反應(yīng)條件：94℃5 min；94℃1 min，55℃50 s，72℃55 s，32個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳20 min檢測是否有目的條帶，純化后由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司進(jìn)行測序。

1.2.4 進(jìn)化樹構(gòu)建 將PCR產(chǎn)物測序所得的核苷酸序列通過美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源檢索（http：／／blast.ncbi.nlm.nih.gov／Blast.cgi）；用ClustalW軟件進(jìn)行多序列比對；Gene.Doc軟件進(jìn)行序列編輯；用MEGA4軟件包中的Neighbor-Joining法構(gòu)建分子進(jìn)化系統(tǒng)樹，并用Bootstrap分析方法對所構(gòu)建的進(jìn)化樹進(jìn)行可靠性檢驗(yàn)。

1.2.5 菌落分生孢子著生狀態(tài)和形態(tài)觀察 將白僵蠶或蛹來源的分離菌株與對照菌株提取的DNA，PCR產(chǎn)物經(jīng)測序后，將ITS序列有差異的菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d（26℃）后，取分生孢子以0.1%Tween-80的無菌水配制成濃度1×107個(gè)／mL的分生孢子懸浮液，然后用接種針分別將各分生孢子懸浮液點(diǎn)植于PDA平板培養(yǎng)基上，每皿3點(diǎn)，成正三角形排列，每個(gè)菌株3個(gè)培養(yǎng)皿，倒置于26℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第7天通過數(shù)碼顯微鏡三維分析系統(tǒng)VHX-900，放大900倍，利用實(shí)時(shí)2D、快速深度合成技術(shù)觀察記錄各菌株分生孢子的著生狀態(tài)。

1.2.6 不同菌株對家蠶致病力的測定 將每個(gè)菌株配制成濃度為1×107個(gè)／mL的分生孢子懸浮液，取5 mL分生孢子懸浮液放在細(xì)胞培養(yǎng)皿（35 mm× 10 mm）中，將2齡起蠶（菁松×皓月）浸2 s后取出正常飼養(yǎng)，每區(qū)20頭蠶，3次重復(fù)。實(shí)驗(yàn)室保存的BJ菌株設(shè)為陽性對照組，處理同上，空白對照組用無菌水處理。每天調(diào)查蠶的死亡情況，3齡起蠶后結(jié)束統(tǒng)計(jì)。蟲尸保濕放置，檢查是否會產(chǎn)生菌絲。計(jì)算僵蟲率，找出致病力較強(qiáng)的菌株。

將致病力較強(qiáng)的菌株分別配制成濃度為1× 102、1×103、1×104、1×105、1×106個(gè)／mL的分生孢子懸浮液，試驗(yàn)方法同上。采用Excel進(jìn)行回歸分析［16］，計(jì)算LC50，并對各菌株進(jìn)行毒力比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 真菌菌株的分離與鑒定

從浙江省淳安縣、桐鄉(xiāng)市、臨安市和桐廬縣等蠶區(qū)采集的86份白僵蠶或蛹樣品中，分離得到53個(gè)菌株，其中：淳安縣9個(gè)菌株，桐鄉(xiāng)市30個(gè)菌株，臨安市9個(gè)菌株，桐廬縣5個(gè)菌株。對53個(gè)分離菌株的DNA特異擴(kuò)增了rDNA的ITS序列（18S rDNA，ITS 1，5.8S rDNA和ITS 2），擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，得到1條清晰目的條帶，分子量在580 bp左右。PCR產(chǎn)物純化經(jīng)雙向測序后，與GeneBank數(shù)據(jù)庫中已登陸的基因序列進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn)：有47個(gè)分離菌株為球孢白僵菌，其中40個(gè)與對照菌株ITS序列完全相同，7個(gè)分離菌株（CA-1、CA-2、CA-10、CA-12、CA-13、CA-15、CA-16）與對照菌株存在個(gè)別堿基差異，并存在3個(gè)不同序列。其余分離菌株中有3個(gè)（TX-1、TX-12和TX-13）為蠟蚧屬（Lecanicillium），其種名分別為L.attenuatum［17］、L.saksenae［18］、L.aphanocladii［19］；3個(gè)分離菌株（CA-6、CA-20和TX-30）為擬青霉屬（Paecilomy?ces），即家蠶灰僵菌，但通過NCBI數(shù)據(jù)庫Blast比對尚不足以鑒定到具體的“種”，需進(jìn)一步結(jié)合形態(tài)學(xué)特征確定種名，結(jié)果見表1。

表1 分離菌株基于ITS序列分析的分類鑒別

2.2 分子進(jìn)化樹分析

將同屬白僵菌屬但I(xiàn)TS序列存在差異的3個(gè)分離菌株CA-1、CA-12和CA-15，及擬青霉屬的CA-6和蠟蚧屬的TX-1、TX-12、TX-13與對照菌株BJ進(jìn)行核苷酸序列聯(lián)配比較，采用MEGA的Neighbor?Joining法構(gòu)建ITS序列系統(tǒng)進(jìn)化樹，如圖1所示。從系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果分析，分離菌株可被劃分為3類：CA-15、CA-12、CA-1與對照菌株BJ聚為一類，置信值為100%，親緣關(guān)系密切；蠟蚧菌TX-1、TX-12、TX-13聚為一類，置信值大于80%；灰僵菌CA-6自成一類。

圖1 基于ITS核酸序列的系統(tǒng)樹

2.3 菌落特征和分生孢子的形態(tài)

從表2可以看出，將7個(gè)分離菌株（CA-1、CA-12、CA-15、CA-6、TX-1、TX-12、TX-13）及對照菌株BJ在PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行菌落形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，不同屬間菌株表現(xiàn)出不同的形態(tài)特征。

2.4 分生孢子的著生狀態(tài)

從菌株分生孢子的著生狀態(tài)來看，白僵菌BJ（對照）、CA-1、CA-12、CA-15的分生孢子梗多與氣生菌絲呈直角分叉對生或散生狀態(tài)，在頂生的分生孢子下方不遠(yuǎn)處反復(fù)分枝產(chǎn)孢，形成“之”字形彎曲的產(chǎn)孢軸，成簇生長的分生孢子梗上的分生孢子集積而成為葡萄狀；蠟蚧菌TX-1、TX-12、TX-13分生孢子梗為離散的皮刺狀，輪狀著生或單生，長錐型，端部漸狹；灰僵菌CA-6在培養(yǎng)基上培養(yǎng)數(shù)日后集積的分生孢子呈淡灰色，在分生孢子梗上下的每個(gè)小梗頂端串生分生孢子形成孢子鏈（圖2）。

表2 ITS序列有差異的菌株在PDA培養(yǎng)基上的形態(tài)特征比較

圖2 不同白僵菌菌株分生孢子的生長形態(tài)

2.5 不同白僵菌菌株對家蠶的致病力測定

選用2齡起蠶（菁松×皓月），配制孢子懸浮液濃度為1×107個(gè)／mL，采用浸蟲法［20-21］測定各分離菌株的致病力。從表3可見，不同白僵菌菌株對家蠶的致病力不同，CA-12、CA-15這2個(gè)菌株的致病力較高，對家蠶的致死率分別達(dá)到76.67%、 53.33%，TX-1、CA-1、CA-6這3個(gè)菌株的致病力相對偏弱，對家蠶的致死率分別為28.33%、16.67%和10.00%，而TX-12、TX-13這2個(gè)菌株在觀察期內(nèi)未發(fā)現(xiàn)致病力，對家蠶的致死率為0。不同白僵菌菌株對家蠶的致病力依次排序?yàn)镃A-12＞CA-15＞TX-1＞CA-1＞CA-6＞TX-12＝TX-13。

表3 不同白僵菌菌株對家蠶的致病力（2～3齡）

根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果，我們進(jìn)一步做菌株篩選試驗(yàn)。選取初篩致病力較高的菌株CA-12和對照菌株BJ，分別配成濃度為1×102、1×103、1×104、1×105、1×106個(gè)／mL的孢子懸浮液，將2齡起蠶浸漬2 s后正常飼養(yǎng)，計(jì)算LC50，結(jié)果顯示CA-12菌株的LC50為8.48×105個(gè)／mL，對照菌株BJ的LC50為1.32× 105個(gè)／mL，說明對照球孢白僵菌的家蠶致病力較強(qiáng)（表4）。

表4 高致病性球孢白僵菌LC50測定

3 討論

白僵菌通過ITS法能夠準(zhǔn)確快速地鑒定出多數(shù)菌株的種名，但對于個(gè)別核酸序列數(shù)據(jù)庫中的相同序列較多時(shí)，需結(jié)合序列比對分析或結(jié)合形19:34 2017/5/17態(tài)學(xué)、生化等表型方法進(jìn)行鑒定。本研究通過ITS序列分析對不同來源的菌株進(jìn)行鑒定，53個(gè)菌株中有47個(gè)為球孢白僵菌屬，3個(gè)為蠟蚧屬（家蠶蠟蚧頭孢霉）［22-23］，3個(gè)為擬青霉屬（家蠶灰僵菌），表明感染家蠶表現(xiàn)出白僵病癥狀的病原種類呈多樣性，球孢白僵菌是主要病原菌。另外，發(fā)現(xiàn)淳安地區(qū)球孢白僵菌間的ITS的差異位點(diǎn)較多，推測是由于白僵菌在自然群體中存在較高的遺傳多樣性或物種變異所導(dǎo)致，與該地區(qū)屬于山林地區(qū)，野外昆蟲數(shù)量較多有關(guān)。7個(gè)分離菌株（CA-1、CA-12、CA-15、CA-6、TX-1、TX-12、TX-13）在相同的培養(yǎng)條件下，菌落形態(tài)、分生孢子形態(tài)等生物學(xué)性狀均存在一定的差異，即使來自同一蠶區(qū)淳安縣的白僵菌菌株CA-1、CA-12、CA-15之間，生物學(xué)性狀也存在差別，說明相同蠶區(qū)的家蠶白僵病病原存在差異，與家蠶白僵病病原的復(fù)雜性一說相吻合［24］。

家蠶的致病力是反映菌株性狀的重要指標(biāo)之一。通過家蠶致病力試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同種類、不同來源的7個(gè)分離菌株對家蠶的致病力存在差異，家蠶致病力依次為CA-12（球孢白僵菌屬，76.67%）＞CA-15（球孢白僵菌屬，53.33%）＞TX-1（蠟蚧屬，28.33%）＞CA-1（球孢白僵菌屬，16.67%）＞CA-6（擬青霉屬，10.00%）＞TX-12（蠟蚧屬，0）＝TX-13（蠟蚧屬，0），球孢白僵菌對家蠶的致病力最強(qiáng)，病勢也最急，其他菌株對家蠶的致病力有高有低［25］。同時(shí)，在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)同樣來源于桐鄉(xiāng)地區(qū)的蠟蚧屬菌株TX-1（L.attenuatum）、TX-12（L.saksenae）和TX-13（L.aphanocladii）對家蠶的致病力存在較大的差異。根據(jù)文獻(xiàn)［22］可知，蠟蚧菌的半致死濃度LC50為2.55×106個(gè)／mL，本試驗(yàn)配制的蠟蚧屬菌株孢子濃度為1×107個(gè)／mL，所配溶液濃度高于半致死濃度，而只發(fā)現(xiàn)TX-1菌株對家蠶有致病性，TX-12和TX-13菌株回感沒有使家蠶發(fā)病，推測蠟蚧菌不同的“種”對家蠶的致病性有差異。

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S884.3＋1

A

1007-0982（2015）03-0032-06

2015-04-21；接受日期:2015-06-15

杭州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號20091832B09）。

苘娜娜（1983—），女，山東威海，碩士研究生，農(nóng)藝師。E?mail：49449341＠qq.com

魯興萌，男，教授，博士生導(dǎo)師。Tel：0571-88982305，E?mail：xmlu＠zju.edu.cn