穆成 王志銳 趙慧 王艷楠 王春花

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GenoType?MTBDRsl試劑盒檢測Mtb對氧氟沙星耐藥性的效果評價(jià)

穆成 王志銳 趙慧 王艷楠 王春花

耐藥結(jié)核病已經(jīng)成為我國結(jié)核病控制工作面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。早期快速診斷對于耐藥結(jié)核病的治療和預(yù)防控制起著重要的作用?；谂囵B(yǎng)方法檢測結(jié)核分枝桿菌的耐藥性常需要數(shù)周時(shí)間，已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足結(jié)核病臨床和防治工作的需要。

近年來, 隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，出現(xiàn)了通過檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥基因快速篩選或診斷耐藥結(jié)核病的方法，如基因芯片及分子分析技術(shù)(包括GenoType?MTBDRplus、Xpert Mtb/RIF等)，但多限于檢測利福平耐藥相關(guān)基因rpoB和異煙肼耐藥相關(guān)基因katG、inhA。2009年，德國Hain Lifescience公司推出了二線抗結(jié)核藥物耐藥快速診斷GenoType?MTBDRsl試劑盒[1]。該試劑盒可以檢測氟喹諾酮類藥物(如氧氟沙星、莫西沙星)耐藥相關(guān)基因gyrA、氨基糖苷類抗生素(如卡那霉素、阿米卡星)耐藥相關(guān)基因rrs和乙胺丁醇耐藥相關(guān)基因embB的突變，從而檢測結(jié)核分枝桿菌對這些藥物的耐藥性。

本研究應(yīng)用GenoType?MTBDRsl試劑盒檢測天津地區(qū)結(jié)核分枝桿菌臨床分離株對氧氟沙星的耐藥性，并與傳統(tǒng)比例法藥物敏感性試驗(yàn)(簡稱“藥敏試驗(yàn)”)結(jié)果進(jìn)行比較，現(xiàn)將有關(guān)研究報(bào)告如下。

材料和方法

一、材料

1. 菌株來源：113株菌株來自于 2012年7月至2014年6月天津市結(jié)核病控制中心門診確診肺結(jié)核患者的臨床分離株。

2. 主要試劑和儀器：GenoType?MTBDRsl試劑盒(批號：KU00048)和Hotstar Taq DNA聚合酶(批號：QQ00013)均購自德國 Hain Lifescience公司；分枝桿菌硝基苯甲酸(PNB)培養(yǎng)基(批號：20140812)、分枝桿菌藥敏改良羅氏培養(yǎng)基(批號：20140813)、分枝桿菌藥敏試驗(yàn)氧氟沙星培養(yǎng)基(批號：20140812)均購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。PCR儀(Eppendorf mastercycler epgradient S，德國)，TwinCubator?雜交儀(Hain Lifescience, 德國)。

二、 方法

1. 檢測技術(shù)：采用病例對照方法，對所入選的113株臨床分離株同時(shí)進(jìn)行菌群鑒定、羅氏培養(yǎng)基比例法藥敏試驗(yàn)和GenoType?MTBDRsl試劑盒檢測。

2. 菌群鑒定和比例法藥敏試驗(yàn)：使用硝基苯甲酸(PNB)培養(yǎng)基鑒定結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群。使用羅氏培養(yǎng)基比例法測定菌株對氧氟沙星的耐藥性[2]。

3. DNA提?。河媒臃N環(huán)取一環(huán)約10 mg菌培養(yǎng)基上的菌落，置于300 μl分子生物學(xué)級無菌水中，95 ℃水浴20 min。20 000×g，離心5 min。將上清即提取的DNA轉(zhuǎn)移至新管。

4. 耐藥性快速檢測： 采用GenoType?MTBDRsl試劑盒進(jìn)行耐藥性快速檢測，按該試劑盒操作手冊進(jìn)行。準(zhǔn)備PCR擴(kuò)增體系50 μl(引物及dNTP混合物 35 μl，10×PCR緩沖液 5 μl, MgCl22 μl, HotStarTaq DNA聚合酶 0.2 μl,去離子水3 μl，提取的DNA模板5 μl)進(jìn)行PCR試驗(yàn)。擴(kuò)增條件：95 ℃ 15 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 2 min，10個(gè)循環(huán)；95 ℃ 25 s，53 ℃ 40 s，70 ℃ 40 s，30個(gè)循環(huán)；70 ℃ 8 min。取20 μl PCR產(chǎn)物加入雜交盤，與20 μl分離試劑混合，室溫變性5 min。放入帶有探針的測試條，將雜交盤放入TwinCubator?雜交儀，進(jìn)行雜交及顯色。結(jié)果按照使用手冊進(jìn)行判讀：檢測試紙條上有3個(gè)質(zhì)控探針，分別是顯色質(zhì)控(CC)、擴(kuò)增質(zhì)控(AC)和鑒定結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群質(zhì)控(TUB)。針對gyrA基因，有1條質(zhì)控探針，3條野生型探針，6條突變探針。針對rrs基因，有1條質(zhì)控探針，2條野生型探針，2條突變探針。針對embB基因，有1條質(zhì)控探針，1條野生型探針，2條突變探針。當(dāng)野生型探針顯色缺失或野生型探針顯色缺失與突變探針顯色同時(shí)存在，判定為耐藥；當(dāng)野生型探針無顯色缺失同時(shí)突變探針無顯色時(shí)，判定為敏感。

5. 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料的一致性比較使用Kappa檢驗(yàn)。K值≥0.75認(rèn)為一致性很好[3]。

結(jié) 果

113株臨床分離株經(jīng)鑒定均為結(jié)核分枝桿菌。使用GenoType?MTBDRsl試劑盒檢測113株臨床分離株對氧氟沙星的耐藥性，與比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果比較的結(jié)果見表1。以比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果為判斷標(biāo)準(zhǔn)，使用GenoType?MTBDRsl檢測氧氟沙星耐藥性的敏感度為83.3%(40/48)，特異度為95.4%(62/65)，陽性預(yù)測值為93.0%(40/43)，陰性預(yù)測值為88.6%(62/70)，總符合率為90.3%(102/113)。對兩種方法進(jìn)行一致性Kappa檢驗(yàn)，K=0.798，P<0.001。

表1 兩種技術(shù)檢測Mtb對氧氟沙星耐藥性結(jié)果的比較

討 論

一、 氧氟沙星耐藥的基因診斷

氧氟沙星是氟喹諾酮類藥物中的一種，廣泛應(yīng)用于臨床治療中。近年來，結(jié)核分枝桿菌對氧氟沙星的耐藥問題引起了人們的重視。2007年全國結(jié)核病耐藥性基線調(diào)查顯示，氧氟沙星耐藥率為3.49%，以此估算，全國對氧氟沙星耐藥的結(jié)核病患者超過5萬例[4]。氧氟沙星通過與細(xì)菌DNA解旋酶結(jié)合，抑制細(xì)菌DNA復(fù)制或轉(zhuǎn)錄，從而起到殺菌作用。DNA解旋酶包括2個(gè)A亞基和2個(gè)B亞基，分別由gyrA和gyrB基因編碼。氧氟沙星耐藥與gyrA基因氟喹諾酮耐藥決定區(qū)(quinolone resistance determining region，QRDR)的基因突變相關(guān)[5]。GenoType?MTBDRsl技術(shù)基于PCR-線性探針雜交檢測原理，可以同時(shí)檢測gyrA、rrs和embB3種基因，判斷結(jié)核分枝桿菌對氟喹諾酮類藥物、氨基甙類藥物和乙胺丁醇的耐藥性。該方法操作簡單，可在24 h內(nèi)獲得藥敏試驗(yàn)結(jié)果，使得對相關(guān)藥物的耐藥診斷時(shí)間大大縮短。由于對氨基甙類藥物和乙胺丁醇耐藥的菌株較少，本研究主要評價(jià)GenoType?MTBDRsl試劑盒在檢測氧氟沙星耐藥性中的效果，待以后的研究中加大樣本量，更好地說明該方法的應(yīng)用價(jià)值。

本研究中，113株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株經(jīng)GenoType?MTBDRsl試劑盒檢測對氧氟沙星耐藥性的敏感度和特異度分別為83.3%和 95.4%。于傳統(tǒng)比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行Kappa一致性檢驗(yàn)，K值大于0.75，P<0.001，提示兩種方法具有較高的一致性。

二、GenoType?MTBDRsl檢測方法的現(xiàn)狀與展望

關(guān)于GenoType?MTBDRsl檢測方法，國外已有相關(guān)報(bào)道。Feng等[6]對14項(xiàng)關(guān)于GenoType?MTBDRsl試劑盒的應(yīng)用研究采用Meta分析進(jìn)行了系統(tǒng)性回顧，涉及德國、法國、荷蘭、俄羅斯、南非、埃塞俄比亞等多個(gè)國家和地區(qū)。GenoType?MTBDRsl試劑盒檢測Mtb對氧氟沙星耐藥的敏感度平均為87.4%(95%CI：84.5%～89.9%),特異度平均為97.1%(95%CI：96.1%～98.0%)。目前，國內(nèi)尚無有關(guān)GenoType?MTBDRsl試劑盒檢測Mtb對氧氟沙星耐藥性的報(bào)道。國內(nèi)一些學(xué)者通過DNA測序研究gyrA基因突變與氧氟沙星耐藥性的關(guān)系。相關(guān)報(bào)道顯示，國內(nèi)氧氟沙星耐藥菌株gyrA基因突變率為75%～84.4%[7-10]。與國外研究相比，本研究敏感度、特異度稍低，考慮可能由于不同國家地區(qū)流行菌株有差異所致。

目前，只見到GenoType?MTBDRsl試劑盒檢測分離的菌株和涂陽痰標(biāo)本的報(bào)道，對涂陰痰標(biāo)本和其他肺外標(biāo)本的檢測報(bào)道甚少。此外，使用肉眼直接判讀結(jié)果，存在一定的主觀性和誤差。這些都有待進(jìn)一步改進(jìn)。目前德國Hain Lifescience公司已經(jīng)研制出全自動(dòng)掃描判讀儀并在國外實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)用。

總之，使用GenoType?MTBDRsl試劑盒檢測Mtb對氧氟沙星的耐藥性,是一種快速、靈敏、特異度高的診斷方法。該方法可以盡早地獲得藥敏試驗(yàn)結(jié)果，使耐藥患者能夠及時(shí)地得到規(guī)范的化療，可以在有條件的地區(qū)推廣使用。

[1] Hillemann D, Rüsch-Gerdes S, Richter E.Feasibility of the GenoType MTBDRsl assay for fluoroquinolone, amikacin-capreomycin, and ethambutol resistance testing ofMycobacteriumtuberculosisstrains and clinical specimens. J Clin Microbiol， 2009,47(6):1767-1772.

[2] 中國防癆協(xié)會(huì)基礎(chǔ)專業(yè)委員會(huì).結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程.北京:中國教育文化出版社,2006:1-117.

[3] 張治國，歐喜超，孫倩，等.利福平耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增技術(shù)檢測痰標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌及其耐藥性的研究.中國防癆雜志，2013,35(1)：13-16.

[4] 中華人民共和國衛(wèi)生部.全國結(jié)核病耐藥性基線調(diào)查報(bào)告(2007—2008年).北京:人民衛(wèi)生出版社，2010:23-37.

[5] Ginsburg AS, Grosset JH, Bishai WR.Fluoroquinolones,tuberculosis,and resistance. Lancet Infect Dis，2003,3(7):432-442.

[6] Feng Y,Liu S,Wang Q,et al. Rapid diagnosis of drug resis-tance to fluoroquinolones, amikacin, capreomycin, kanamycin and ethambutol using genotype MTBDRsl assay: a meta-ana-lysis. PLoS One，2013,8(2):e55292.

[7] 嚴(yán)蓉，李召東，黃海軍，等.江省結(jié)核分枝桿菌臨床分離株gyrA基因突變與氧氟沙星耐藥的相關(guān)性.中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2013,23(14):2993-2995.

[8] 趙麗麗，夏強(qiáng)，趙秀芹，等.耐多藥結(jié)核分枝桿菌對喹諾酮類藥物的耐藥性與gyr基因突變的初步研究.中國人獸共患病學(xué)報(bào)，2011,27(5):390-393.

[9] 趙玉玲，馬曉光，李輝.98株河南省結(jié)核分枝桿菌氧氟沙星耐藥株gyrA基因突變的研究.中國人獸共患病學(xué)報(bào),2012,28(5):503-505.

[10] 盧峰岳，俞日霞，胡族瓊，等.結(jié)核分枝桿菌DNA促解旋基因突變與耐氟喹諾酮類藥物的相關(guān)性研究.中國防癆雜志，2014,36(6)：429-433.

(本文編輯：王然 薛愛華)

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.10.016

300041 天津市結(jié)核病控制中心參比實(shí)驗(yàn)室

穆成，Email：mucheng2007@hotmail.com

2015-03-13)